[發明專利]一種重組突變型Tn5轉座酶的制備及應用

有效

• 申請號: 202110445159.4
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113136374B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發明（設計）人: 呂培濤;朱文俊
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/10;C12N15/62;C07K19/00;C12N15/70;C12Q1/6806
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 劉佳;蔡學俊

本發明提供了一種重組突變型Tn5轉座酶的制備及應用，可極大提高Tn5重組蛋白的表達量、增強Tn5蛋白的活性并優化了Tn5蛋白穩定性。該轉座酶能夠明顯提高DNA文庫構建的效率，減少DNA文庫構建過程中目標產物的損失，并能夠適用于多種類型二代高通量測序文庫的構建。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種重組突變型Tn5轉座酶的制備及應用。

背景技術

轉座酶是一類具有執行轉座能力的蛋白質，可以識別并結合轉座子上特異性序列，將轉座子通過復制或者剪切的模式隨機插入到DNA序列上。由于轉座酶的這種特性，許多轉座酶被開發和改造為一種分子生物學研究工具，用于二代測序技術中的文庫構建。與傳統高通量二代測序的文庫構建方法：“核酸片段化—末端修復—3’端加A—接頭連接”相比較，轉座酶只需要一步就可以完成，大大提高文庫構建的效率并減少文庫構建過程中目標產物的損耗。

Tn5轉座酶是隨機轉座子插入形成轉座體的關鍵酶，被廣泛用于高通量二代測序文庫構建，但由于野生型Tn5蛋白表達量低，酶活性極弱，穩定性差等原因，無法用于二代測序文庫構建。目前市場上的Tn5蛋白，仍存在活性不足、不耐儲存、結合能力弱等缺點，尚無法同時滿足多種類型二代高通量測序文庫的構建需求。

本發明提供了一種重組突變型Tn5轉座酶的制備及應用，可極大提高Tn5重組蛋白的表達量、增強Tn5蛋白的活性并優化了Tn5蛋白穩定性，能夠適用于多種類型二代高通量測序文庫的構建并提高建庫效率。

發明內容

本發明提供了一種重組突變型Tn5轉座酶的制備及應用，增加了Tn5重組蛋白的表達量，酶活性以及穩定性，能夠明顯提高DNA文庫構建的效率，減少DNA文庫構建過程中目標產物的丟失，同時適用于多種類型二代高通量測序文庫的構建。

本發明的技術方案：

本發明為一種重組突變型Tn5轉座酶的制備及應用。其特征在于，將Tn5轉座酶與大腸桿菌內源性蛋白EF融合形成融合蛋白，能夠極大的增強Tn5蛋白的表達量以及正確折疊的效率。突變型是指通過點突變技術，在原突變型（E54K和L372P）Tn5的基礎上進一步改造（突變其中兩個位點，M56A與E345K）得到高酶活性、高穩定性的突變體Tn5轉座酶。本發明的Tn5轉座酶可應用于多種類型二代高通量測序文庫的構建，對提高二代高通量測序文庫構建的效率和減少文庫構建過程中目標產物的損耗具有明顯的作用。本發明還設計了另一種可供選擇的大腸桿菌內源性蛋白TRX1，與突變型Tn5蛋白形成融合蛋白，同樣可以得到高酶活性，高穩定性的突變型Tn5轉座酶，可應用于多種二代高通量測序文庫類型的構建，對提高二代高通量測序文庫構建的效率以及減少文庫構建過程中目標產物的損耗具有明顯作用。本發明步驟簡單、可操作性強、效果顯著。上述大腸桿菌內源性蛋白EF氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；現有突變型大腸桿菌Tn5轉座酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，大腸桿菌內源性蛋白TRX1氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明包含Tn5蛋白表達載體的構建、表達與分離純化、與接頭裝配成Tn5轉座酶、驗證Tn5轉座酶活性以及二代高通量文庫的構建試驗等多個步驟。具體步驟如下：

1. 構建含有多個有益突變位點的Tn5蛋白表達載體

利用特定的點突變引物對Tn5轉座酶DNA片段進行PCR擴增，獲得目標位點突變的Tn5轉座酶DNA片段Tn5m，通過重組技術將大腸桿菌內源性蛋白EF或TRX1的DNA序列和Tn5m片段克隆到蛋白表達載體中。

2. 重組突變型Tn5蛋白的表達、分離純化與濃度測定

將步驟1中所得載體轉化表達菌株中，隨后在含有相應濃度抗生素的液體培養基中擴大培養和分離純化得到高純度的重組突變型Tn5蛋白。通過BCA試劑盒（Pierce，23250）測定純化的蛋白濃度。將得到的重組突變型Tn5蛋白與退火形成的接頭按一定比例孵育，裝配組成重組突變型Tn5轉座酶。