[發明專利]一種依替米星酶聯免疫測定方法

在審

• 申請號: 202110444873.1
• 申請日: 2021-04-24
• 公開（公告）號: CN113189325A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 徐鳳蓮;戴亞妮;張小娜;張萍;邱婷
• 申請（專利權）人: 無錫濟煜山禾藥業股份有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為;涂榮昌

本發明涉及一種依替米星酶聯免疫測定方法，所述方法，包括使用兩種不同種屬的特異性依替米星單克隆抗體，命名為抗體1，抗體2，其中，將抗體1固化到載體，抗體2進行辣根過氧化物酶標記，然后利用標準曲線對依替米星含量進行檢測。

技術領域

本發明涉及一種藥物檢測方法，特別涉及一種依替米星酶聯免疫吸附測定方法，具體涉及一種基于固化的依替米星抗體、加入依替米星和辣根過氧化物酶標記的依替米星抗體，通過雙抗夾心酶聯免疫法測定依替米星含量。

背景技術

依替米星(etimicin sulfate)，又名愛大霉素，是一種新的半合成水溶性氨基糖苷類抗生素，對靜止期細菌的殺滅作用強，其作用機制是抑制敏感菌正常的蛋白質合成。

依替米星因為只有紫外末端吸收難以用紫外檢測器進行測定，目前較普遍的為通過采用通用型檢測器如示差折光檢測器和蒸發光散射檢測器或采用離子色譜儀電化學檢測方法檢測依替米星的含量。

酶聯免疫分析技術的基本原理就是利用酶標記的抗原或抗體之間的反應，通過酶作用底物的顯色以對抗體或抗原進行分析。目前還沒有見到利用酶聯免疫分析技術進行依替米星含量檢測的報道。

采用精密儀器(如液相色譜儀等)在依替米星含量測定上有一定的優勢，但由于儀器設備價格昂貴、維護成本較高、檢測周期較長，對檢測人員的要求較高，因此開發一種操作方便、用時較短、重現性好的檢測方法對于依替米星的生產研究和工藝開發都有非常積極的意義。

本發明通過酶聯免疫吸附測定方法檢測依替米星的含量，具有安全準確、成本較低、測定周期較短、重現性好、一次性檢測樣本量大等特點。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供一種依替米星的含量測定方法，采用雙抗體夾心酶聯免疫方法，方法中包括使用兩種不同種屬的特異性依替米星單克隆抗體，命名為抗體1，抗體2，其中，將抗體1固化到載體，抗體2進行辣根過氧化物酶標記，然后利用標準曲線對依替米星含量進行檢測。

優選的，本發明所述方法，包括以下步驟：

步驟1，待測樣品的配制：依替米星原料藥或依替米星注射液，經超純水溶解或稀釋成依替米星終濃度為10μg/mL～30μg/mL；

步驟2，依替米星抗體1包被：取依替米星抗體1，包被于固相載體上；

步驟3，將標準品、待測樣品、辣根過氧化物酶標記的抗體2，和步驟2的包被抗體1混合，進行免疫顯色反應；

步驟4，將終止液與步驟3的顯色液混合，終止反應；

步驟5，用分光光度計測定顯色反應液的吸光度，根據標準曲線，計算待測樣品中依替米星的含量。

其中，所述依替米星為以下產品：含有依替米星的原料藥，包括硫酸依替米星，依替米星，鹽酸依替米星，含有依替米星的藥物制劑，包括硫酸依替米星注射劑，硫酸依替米星氯化鈉注射液，依替米星注射劑，鹽酸依替米星注射劑，以及任何一種可供服用的制劑形式，如片劑，膠囊劑，口服液，顆粒劑等。

本發明制備了兩個不同種屬的特異性依替米星單克隆抗體，依替米星抗體1和抗體2。制備方法包括以下步驟：將依替米星偶聯血藍蛋白，與佐劑混合，注射入兩種動物體(選自：小鼠，兔，羊)內，1周后再次注入，3周后再次注入，取動物脾細胞，進行細胞融合、篩選和亞克隆。將篩選后的亞克隆細胞柱注入動物腹腔，收集腹水，進行 SDS-PAGE及ELISA鑒定，并利用親和層析對其進行純化，得到兩個不同屬源的依替米星單克隆抗體，分別稱為抗體1，抗體2(1和2 編號可以任意安排，如，將小鼠抗體命名為抗體1，則另一個兔或羊的抗體則命名為抗體2，反之也可以，目的是將兩種不同種屬的抗體區別開)。通過將一個種屬的特異性抗體固化到載體，另一個不同種屬的抗體進行辣根過氧化物酶標記，利用雙抗體夾心酶聯免疫方法進行依替米星含量的檢測。