[發明專利]一種依替米星酶聯免疫測定方法

在審

• 申請號: 202110444873.1
• 申請日: 2021-04-24
• 公開（公告）號: CN113189325A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 徐鳳蓮;戴亞妮;張小娜;張萍;邱婷
• 申請（專利權）人: 無錫濟煜山禾藥業股份有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為;涂榮昌

1.一種依替米星含量測定方法，所述方法，采用雙抗體夾心酶聯免疫方法，方法中包括使用兩種不同種屬的特異性依替米星單克隆抗體，命名為抗體1，抗體2，其中，將抗體1固化到載體，抗體2進行辣根過氧化物酶標記，然后利用標準曲線對依替米星含量進行檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，包括以下步驟：

步驟1，待測樣品的配制：依替米星原料藥或依替米星注射液，經超純水溶解或稀釋成依替米星終濃度為10μg/mL～30μg/mL；

步驟2，依替米星抗體1包被：取依替米星抗體1，包被于固相載體上；

步驟3，將標準品、待測樣品、辣根過氧化物酶標記的抗體2，和步驟2的包被抗體1混合，進行免疫顯色反應；

步驟4，將終止液與步驟3的顯色液混合，終止反應；

步驟5，用分光光度計測定顯色反應液的吸光度，根據標準曲線，計算待測樣品中依替米星的含量。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，依替米星抗體1和抗體2的制備方法包括以下步驟：將依替米星偶聯血藍蛋白，與佐劑混合，注射入兩種動物體內，1周后再次注入，3周后再次注入，取動物脾細胞，進行細胞融合、篩選和亞克隆。將篩選后的亞克隆細胞柱注入動物腹腔，收集腹水，進行SDS-PAGE及ELISA鑒定，并利用親和層析對其進行純化，得到兩個不同屬源的依替米星單克隆抗體，分別稱為抗體1，抗體2。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，依替米星抗體包被的方法是用包被緩沖液將鼠源依替米星抗體按需要稀釋，向酶標板微孔中加入抗體稀釋液，放入4℃環境中過夜孵育；傾去包被液，用洗滌液洗滌，在每孔中加入封閉液，37℃孵育；傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述辣根過氧化物酶標記依替米星抗體，制備方法為過碘酸鈉法。

6.根據權利要求1所述的方法，其中，固相載體選自：聚苯乙烯、硝酸纖維素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交聯葡萄糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠；包被液為pH9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液，碳酸鹽緩沖溶液含1.59g碳酸鈉和2.93g碳酸氫鈉，超純水1L，封閉液為1％牛血清白蛋白溶液；其中，底物液A為含有過氧化氫或過氧化脲的pH4.0檸檬酸緩沖溶液；底物液B為含有3，3，5，5—四甲基聯苯胺或鄰苯二胺的pH4.0檸檬酸緩沖溶液；終止液為1mol/L鹽酸溶液。洗滌液為含1％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH值為7.4，濃度為0.05mol/L。

7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述依替米星抗體是單克隆抗體，或Fab、Fv、ScFv、單域抗體。

8.一種依替米星檢測用酶聯免疫試劑盒，所述試劑盒中含有以下組分：依替米星抗體，所述抗體可以是單克隆抗體，或其Fab、Fv、ScFv及單域抗體。

9.根據權利要求8所述試劑盒，其中含有選自小鼠，兔，羊種兩種不同種屬的依替米星抗體。

10.根據權利要求8所述試劑盒，所述試劑盒中還可含有任何一種用于檢測的試劑及其裝載物，選自：酶標板、顯色液、終止液、標準品，稀釋液，緩沖溶液，等滲溶液，試劑瓶，說明書，面簽，滴定管，取樣器。