[發明專利]miR-29a-3p inhibitor體外誘導人體mBreg細胞的用途及方法

有效

• 申請號: 202110444251.9
• 申請日: 2021-04-23
• 公開（公告）號: CN113512528B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 夏永祥;李近陽
• 申請（專利權）人: 江蘇省人民醫院（南京醫科大學第一附屬醫院）
• 主分類號: C12N5/0781
• 分類號: C12N5/0781
• 代理公司: 南京科知維創知識產權代理有限責任公司 32270
• 代理人: 杜依民

1.miR-29a-3p inhibitor在體外誘導人體mBreg細胞的用途，所述miR-29a-3pinhibitor誘導CD19⁺B細胞向mBreg細胞轉化，所述mBreg細胞為CD19⁺CD24^hiCD27⁺Breg細胞亞群。

2.根據權利要求1所述的miR-29a-3p inhibitor在體外誘導人體mBreg細胞的用途，其特征在于所述CD19⁺B細胞采用如下步驟分選：

第一步：獲取外周血單核淋巴細胞，利用血細胞單采儀獲取濃縮人外周血單個核細胞50~80ml，與生理鹽水或PBS 1：1等比例混合，每30ml一份緩慢沿試管壁加入15ml單核淋巴細胞分離液Ficoll上，兩者不要混勻；20℃、2300rpm，離心23分鐘，取血漿和單核淋巴細胞分離液Ficoll之間細胞云霧層，得單核淋巴細胞懸液；

第二步：將第一步獲得的單核淋巴細胞懸液，20℃、1500rpm離心5分鐘加入洗滌兩次，棄上清，使用血球計數板對細胞數量進行計數，以25 μ l /10⁷加入PBS重懸細胞；加入5 μl /10⁷的CD19⁺Microbeads，室溫孵育30分鐘，PBS洗滌一次后用4ml AUTOMACS BUFFER重懸，啟動AUTOMACS機器，設置陽選程序，分選獲得CD19陽性細胞。

3.一種應用miR-29a-3p inhibitor分離和體外誘導擴增mBreg細胞的方法，其特征在于：包括以下步驟：

第一步：獲取外周血單核淋巴細胞的步驟，利用血細胞單采儀獲取濃縮人外周血單個核細胞50~80ml，與生理鹽水或PBS 1：1等比例混合，每30ml一份緩慢沿試管壁加入15ml單核淋巴細胞分離液Ficoll上，兩者不要混勻；20℃、2300rpm，離心23分鐘，取血漿和單核淋巴細胞分離液Ficoll液之間細胞云霧層，即得單核淋巴細胞懸液；

第二步：分選得到CD19⁺ B細胞的步驟，將第一步獲得的單核淋巴細胞懸液，20℃、1500rpm離心5分鐘加入洗滌兩次，棄上清，使用血球計數板對細胞數量進行計數，以25 μ l/10⁷加入PBS重懸細胞；加入5 μ l /10⁷的CD19⁺Microbeads，室溫孵育30分鐘，PBS洗滌一次后用4ml AUTOMACS BUFFER重懸，啟動AUTOMACS機器，設置陽選程序，分選獲得CD19陽性細胞；

第三步：誘導調節性B細胞的步驟；第二步獲得的CD19陽性細胞，20℃、1500rpm離心5分鐘加入洗滌兩次，棄上清，以0.5*10⁶/ml 的細胞濃度利用培養基重懸，加入miR-29a-3pinhibitor進行培養；

第四步：純度和功能檢測的步驟，3天后10⁶個細胞重懸于100微升PBS中，加入CD19FITC、CD24 PERPCY5.5、CD27 APC流式抗體，4℃避光孵育30-45分鐘，PBS洗滌兩次，使用流式細胞儀檢測細胞mBreg細胞的比例；

所述mBreg細胞為CD19⁺CD24^hiCD27⁺Breg細胞亞群。