[發(fā)明專利]一種用于壞死性小腸結(jié)腸炎研究的細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110443051.1
• 申請(qǐng)日: 2021-04-23
• 公開（公告）號(hào): CN113174409A
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周寅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明公開了一種用于壞死性小腸結(jié)腸炎研究的細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，它是用病毒誘導(dǎo)細(xì)胞的MYD88基因沉默得到細(xì)胞模型。本發(fā)明方法，簡單，高效，易操作，適于工業(yè)化推廣應(yīng)用。通過本發(fā)明構(gòu)建得到的用于壞死性小腸結(jié)腸炎研究的細(xì)胞模型，穩(wěn)定可用于研究壞死性小腸結(jié)腸炎病理機(jī)制，相對(duì)于動(dòng)物模型具有簡便、易得，成本低的優(yōu)勢(shì)，為研究壞死性小腸結(jié)腸炎提供了新的選擇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體涉及一種用于壞死性小腸結(jié)腸炎研究的細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

壞死性小腸結(jié)腸炎為一種獲得性疾病，主要在早產(chǎn)兒或患病的新生兒中發(fā)生，其特征為粘膜甚至為腸深層的壞死，最常發(fā)生在回腸末端，結(jié)腸和近端小腸很少受累。在發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎的新生兒中，在小腸中通常有三個(gè)因素出現(xiàn)：持續(xù)的腸缺血損害，細(xì)菌定植，腸腔內(nèi)底物(如經(jīng)腸喂養(yǎng))。

引起壞死性小腸結(jié)腸炎的原因尚不明確。已確信腸缺血損害可破壞腸道產(chǎn)生粘液，導(dǎo)致腸道易受細(xì)菌侵襲，一旦開始喂養(yǎng)，為腸道細(xì)菌繁殖提供了充足的底物，而細(xì)菌可滲透過腸壁，產(chǎn)生氫氣并積聚，產(chǎn)生X線上特征性的腸壁積氣，氣體并可進(jìn)入門靜脈，通過腹部X線平片或肝臟B超可見到肝臟上面的門靜脈積氣。隨著病變的進(jìn)展，可導(dǎo)致整層腸壁的壞死，穿孔，腹膜炎，敗血癥和死亡。

本發(fā)明人敲除MYD88基因得到的動(dòng)物模型研究證實(shí)，在壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展中，MYD88能夠使腸上皮細(xì)胞凋亡降低，減輕炎癥的發(fā)生，并在《中華小兒外科雜志》上公開發(fā)表了《TLR4通路關(guān)鍵蛋白MyD88在壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)病過程中的作用機(jī)制研究》，但疾病的發(fā)生發(fā)展往往是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果，由于動(dòng)物模型是復(fù)雜的個(gè)體，影響其疾病進(jìn)程的因素眾多，不利于疾病中各個(gè)因素的準(zhǔn)確客觀分析，因此構(gòu)建影響因素更少的細(xì)胞模型用于壞死性小腸結(jié)腸炎病理機(jī)制及篩選治療和/或預(yù)防藥物具有更重要的作用，但由于細(xì)胞分子水平突變的復(fù)雜性致使目前尚無穩(wěn)定MYD88沉默的細(xì)胞模型存在。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于壞死性小腸結(jié)腸炎研究的細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，它是用病毒誘導(dǎo)細(xì)胞的MYD88基因沉默得到細(xì)胞模型；所述病毒為重組慢病毒；所述重組慢病毒中包含沉默MYD88基因的shRNA，所述shRNA序列為

5’-GACAGACTATCGGCTTAAATTCTCGAGAATTTAAGCCGATAGTCTGTC-3’。

進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)的步驟為：

1)取細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到20～60％，得待轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

2)取DMEM培養(yǎng)基，加入慢病毒中，混勻，再加入多聚陽離子化合物Polybrene，得含毒培養(yǎng)基；

3)取步驟2)含毒培養(yǎng)基，覆蓋于步驟1)待轉(zhuǎn)染細(xì)胞上，培養(yǎng)8～12h，移除含毒培養(yǎng)基，加入DMEM培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24h以上，即得壞死性小腸結(jié)腸炎細(xì)胞模型。

更進(jìn)一步地，所述細(xì)胞為大鼠腸上皮細(xì)胞株IEC-6。

更進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)條件為溫度37℃，CO₂濃度5％。

更進(jìn)一步地，步驟1)所述培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到30～50％。

更進(jìn)一步地，步驟2)所述DMEM培養(yǎng)基的用量為使之覆蓋于培養(yǎng)器皿表面為止；所述慢病毒的用量為感染復(fù)數(shù)MOI 20；所述含毒培養(yǎng)基中多聚陽離子化合物Polybrene的濃度為2～7ug/mL，優(yōu)選5ug/mL。

更進(jìn)一步地，所述DMEM培養(yǎng)基中含有胎牛血清，其中胎牛血清與DMEM培養(yǎng)基的質(zhì)量比為10：90；所述DMEM培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基，優(yōu)選Gibco DMEM高糖液體培養(yǎng)基。

本發(fā)明還提供了一種壞死性小腸結(jié)腸炎細(xì)胞模型，它是按照前述方法制備的MYD88基因沉默的細(xì)胞模型。

進(jìn)一步地，所述細(xì)胞為IEC-6細(xì)胞。