[發(fā)明專利]一種檢測BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重?zé)晒舛縋CR方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110441844.X
• 申請日: 2021-04-23
• 公開（公告）號: CN113136455A
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦建華;高亞桃;李妍;史萬玉;劉立元;王猛;郭姚蕊;劉勝麗;王傳文;包永占;趙月蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李興林

本發(fā)明公開了一種檢測BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重?zé)晒舛縋CR方法及試劑盒，屬于獸醫(yī)生物診斷技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的引物組核苷酸序列如SEQ ID NO.1?SEQ IDNO.8所示，其實(shí)現(xiàn)了對牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒的同時(shí)、定量檢測，該檢測方法靈敏度高，特異性好，適用于臨床樣品的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重?zé)晒舛縋CR方法及試劑盒。

背景技術(shù)

新生犢牛腹瀉是臨床上常見的一種疾病，對犢牛身體健康造成嚴(yán)重危害，是造成奶牛產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一。引起犢牛腹瀉的病原有很多，包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲，其中病毒主要有牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhoea virus，BVDV)、牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus，BCoV)、牛輪狀病毒(Bovine Rotavirus，BRV)和牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)等，且呈世界性流行。牛病毒性腹瀉病毒屬于黃病毒科瘟病毒屬，是單股正鏈RNA病毒，感染該病毒的牛主要表現(xiàn)為腹瀉、黏膜發(fā)紺、消化道粘膜糜爛、免疫耐受和持續(xù)性感染等，BVDV自然感染對象是奶牛和黃牛，該病毒引起一種接觸性傳染病-牛病毒性腹瀉/粘膜病(Bovine viral diarrhoea/mucosal disease,BVD/MD，危害嚴(yán)重。牛冠狀病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為不分段的單股正鏈RNA病毒，是引起犢牛腹瀉和呼吸道感染的重要病原，感染BCoV的犢牛主要表現(xiàn)為腹瀉，也可導(dǎo)致成年牛冬痢，呼吸道感染引起牛肺炎等。牛輪狀病毒是呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起犢牛腹瀉的重要病原，患病牛以排水樣稀糞為主要特征，且多可引起繼發(fā)感染。牛傳染性鼻氣管炎病毒可引起牛一種急性、熱性、接觸性傳染病，感染該病毒的牛主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，也是引起牛腸炎型腹瀉的重要病原之一，患病牛有時(shí)可出現(xiàn)帶血性腹瀉，新生犢牛可表現(xiàn)為全身性疾病。

隨著我國科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人民生活水平不斷提高，養(yǎng)殖業(yè)也不斷擴(kuò)大，由BVDV、BCoV、BRV和IBRV四種病毒引起的犢牛腹瀉疾病嚴(yán)重影響著奶牛的健康，給我國奶牛產(chǎn)業(yè)帶來了很大的影響，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對于這四種病毒引起的疾病尚無有效的治療藥物和預(yù)防措施，歐洲國家采取盡快檢出、淘汰患病牛以根除疾病。目前檢測方法主要依賴于病毒的分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、中和試驗(yàn)、間接免疫熒光技術(shù)(IFA)、普通PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)等。但這些試驗(yàn)方法存在周期較長、檢測量較低、費(fèi)用高、操作復(fù)雜、特異性不好等缺點(diǎn)，因此我們迫切需要建立一種快速、靈敏、穩(wěn)定且同時(shí)能檢測BVDV、BCoV、BRV和IBRV四種病毒的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法，為臨床檢測提供一種快速、有效的檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于檢測BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重SYBRGreen I熒光定量PCR引物組。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種檢測BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重SYBR Green I熒光定量PCR方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種檢測BVDV、BCoV、BRV和IBRV的試劑盒。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種用于檢測BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重?zé)晒舛縋CR引物組，所述引物組包括4對引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示：

BVDV-F：5'-ACAGGGCAGTCGTCAGTG-3'(SEQ ID NO.1)

BVDV-R：5'-TTCGTAGCAGTCGGTTGG-3'(SEQ ID NO.2)

BCoV-F：5'-AGTTTGAATTTGCAGAGGGACA-3'(SEQ ID NO.3)