[發明專利]一種人間充質干細胞上清干粉凝膠的制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110441053.7
• 申請日: 2021-04-23
• 公開（公告）號: CN113304103A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 華進聯;艾力·艾爾肯
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A61K9/06
• 分類號: A61K9/06;A61K35/28;A61K47/10;A61K47/22;A61K47/32;A61P17/02;C12N5/0775
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 鐘斌

1.一種人間充質干細胞上清干粉凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下操作：

1)用α-MEM完全培養液培養傳代培養分離的人臍帶間充質干細胞；

2)當細胞生長密度到80～90％度時，收集低傳代人間充質干細胞培養上清液；將收集的上清液無菌離心，棄沉淀取上清，上清液-80℃凍存備用；

3)凍干粉的制備：將-80℃凍存的凝固體通過冷凍干燥機，于真空壓力0.02～0.030mbar、-88℃下蒸發水分48～50h，獲取干細胞上清凍干粉；

4)透明凝膠的的制備：以質量份數計，將0.1份的卡波姆-940加入蒸餾水，充分溶脹；另取0.2～0.3份的阿昔洛韋加入到溶脹好的基質當中，攪拌分散均勻；之后加入15～20份的甘油、5～8份的乙醇、0.4～0.6份的氫氧化鈉、0.2～0.3份的Tween 80和0.2～0.5份尼泊金乙酯鈉鹽，攪拌分散均勻；再加入三乙醇胺調節pH為6～7，之后補齊蒸餾水至88.3份，機械攪拌充分混合均勻，4℃放置12h，得到透明凝膠；

5)在50份透明凝膠中加入4～5份的干細胞上清干粉之后，機械攪拌使其充分混合均勻，得到人間充質干細胞上清干粉水凝膠。

2.如權利要求1所述的人間充質干細胞上清干粉凝膠的制備方法，其特征在于，間充質干細胞的傳代培養包括以下步驟：

(1)將組織塊在α-MEM中清洗，剪碎至1mm³的碎末狀；

(2)吸取預先配好過濾后37℃預熱的0.1％的I型膠原酶反復吹吸，最后全部吸入含膠原酶的50mL離心管中；

(3)封口膜封口后，將其置于37℃恒溫水浴振蕩器中消化1h，每隔10min上下反復顛倒離心管；

(4)1h后，用等量α-MEM培養液中和膠原酶的消化，反復吹吸使其完全中和，1000rpm，5min離心，用來分離成熟的臍帶組織；

(5)棄去上層懸液及上浮的白色脂肪，用20mLα-MEM培養液沖起，吹打均勻后，經100μm濾網過濾后，1000rpm，5min常溫離心；

(6)離心后棄去上層懸液，用1mL含5％Ultra GRO^TM的α-MEM培養液吹打均勻后移入6孔板，放入5％CO₂，37℃恒溫培養箱培養；

待細胞長成80～90％細胞融合后，用TrypLE Express消化細胞，待細胞彼此分離時棄去胰蛋白酶，用培養液重懸細胞，1:3傳代培養。

3.如權利要求1所述的人間充質干細胞上清干粉凝膠的制備方法，其特征在于，收集間充質干細胞上清液包括以下操作：

待臍帶間充質干細胞生長接近80～90％融合，更換新鮮培養基，并進行傳代培養，收集第3～5代的細胞培養上清液；

將上清液用無菌離心管1500rpm，離心10min，棄沉淀取上清液，-80℃超低溫冰箱中預凍12-24h。

4.如權利要求1所述的人間充質干細胞上清干粉凝膠的制備方法，其特征在于，所述低傳代人間充質干細胞培養上清液包括分別收集臍帶間充質原代及其體積4～5倍的2～3傳代干細胞上清；上清液-80℃凍存備用；

將-80℃凍存的凝固體通過冷凍干燥機，于真空壓力0.02mbar、-88℃下蒸發水分48～50h，除去冰晶；最后制得原代臍帶間充質干細胞上清液凍干粉，-80℃保存。

5.權利要求1或4所制備的人間充質干細胞上清液提取物凍干粉在制備促皮膚傷口愈合/創傷修復的藥物中的應用。

6.權利要求1或4所制備的人間充質干細胞上清干粉凝膠在制備促皮膚傷口愈合/創傷修復的藥物中的應用。