[發明專利]一種可有效識別假陽性信號的雙分子熒光互補技術

有效

• 申請號: 202110440775.0
• 申請日: 2021-04-23
• 公開（公告）號: CN113514433B
• 公開（公告）日: 2023-03-17
• 發明（設計）人: 陳匡時;馬昭;毛詩琦;應亞宸
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

本發明公開了一種可有效識別假陽性信號的雙分子熒光互補(BiFC)技術，通過加入參考熒光蛋白的方法對現有BiFC成像技術進行改進。本發明將參考熒光蛋白與標記熒光蛋白的N端或C端片段連接形成融合蛋白，通過參考熒光蛋白的熒光信號強度表征質粒載體的表達水平，并對表征BiFC信號的標記熒光蛋白的熒光信號強度進行歸一化處理，以標記熒光蛋白與參考熒光蛋白的熒光信號強度比值作為識別假陽性信號的參數。本發明可以簡單高效地應用于各種研究蛋白質?蛋白質相互作用的BiFC標記系統，在不影響BiFC成像效果的前提下識別假陽性信號，克服現有工具存在的無法區分真實信號和假陽性信號的問題。

技術領域

本發明涉及在活細胞中研究蛋白質-蛋白質相互作用的熒光成像方法，具體涉及一種可有效識別假陽性信號的雙分子熒光互補技術。

背景技術

以蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-Protein Interactions，PPIs)為基礎的信號通路網絡在眾多生物學過程中扮演著非常重要的角色。盡管一些傳統的實驗方法，如免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)和酵母雙雜交(Yeast Two-Hybrid Assay)等，可以比較準確地鑒別蛋白質-蛋白質相互作用，但這些技術仍有一定的局限性，例如，它們都無法在活細胞生理條件下對細胞內的蛋白質-蛋白質相互作用進行直接觀察和研究。為了解決這一問題，幾種基于不同原理的活細胞蛋白質-蛋白質相互作用可視化技術被相繼開發應用，其中最具代表性的兩種分別為熒光共振能量轉移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer，FRET)技術和雙分子熒光互補(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)技術。FRET技術基于兩個激發和發射光譜有一定重疊的熒光蛋白在空間距離足夠靠近時所發生的能量轉移現象，可以實時檢測瞬間發生的蛋白質-蛋白質相互作用，但其對目標蛋白發生相互作用的距離以及排列方式有較高要求，并且對于較弱的相互作用檢測能力有限。BiFC技術利用熒光蛋白N末端和C末端這兩個非熒光片段之間的結構互補能力來檢測蛋白質-蛋白質相互作用。該方法分別將這兩個非熒光片段與可能發生相互作用的兩個目標蛋白融合，如果兩個目標蛋白確實發生相互作用，非熒光片段會由于空間距離的靠近而緊密結合并重構形成完整的熒光蛋白，進而可以使用熒光顯微鏡進行成像和定量計算。相比于FRET技術，BiFC技術具有易實現、靈敏度高等優勢，可以檢測到較弱的蛋白質-蛋白質相互作用。近十幾年來，基于BiFC技術的實驗方法已經被廣泛應用于各類蛋白質-蛋白質相互作用的研究。

盡管具備上述優點，BiFC技術在用于可視化蛋白質-蛋白質相互作用時仍存在假陽性信號較高的問題。這是由于兩個非熒光片段N末端和C末端即使沒有連接融合蛋白，也會由于隨機碰撞導致空間距離靠近，引起自發的組裝，進而產生大量假陽性信號。現行的實驗方案無法有效區分由目標蛋白特異性結合產生的真實BiFC信號與由隨機碰撞產生的假陽性信號。此外，BiFC熒光信號的強度嚴重依賴其表達質粒在細胞中的轉染水平，細胞間質粒轉染水平的差異也會影響研究人員對蛋白質-蛋白質相互作用強弱的判斷。

發明內容

針對上述BiFC技術的不足，本發明通過加入參考熒光蛋白的方法對現有BiFC成像技術進行改進，旨在開發出一種能夠有效識別假陽性信號的熒光標記方法，克服現有工具存在的無法區分真實信號和假陽性信號的問題。

本發明提供的技術方案的策略如下：