[發(fā)明專(zhuān)利]一種可有效識(shí)別假陽(yáng)性信號(hào)的雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110440775.0
• 申請(qǐng)日: 2021-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113514433B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳匡時(shí);馬昭;毛詩(shī)琦;應(yīng)亞宸
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/64
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 北京萬(wàn)象新悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

1.一種能夠有效識(shí)別假陽(yáng)性信號(hào)的雙分子熒光互補(bǔ)標(biāo)記系統(tǒng)，包括用于待測(cè)蛋白A和標(biāo)記熒光蛋白的N端片段融合表達(dá)的第一載體，以及用于待測(cè)蛋白B和標(biāo)記熒光蛋白的C端片段融合表達(dá)的第二載體，其特征在于，在所述第一載體或第二載體上，所述標(biāo)記熒光蛋白的N端片段或C端片段融合表達(dá)一個(gè)參考熒光蛋白，所述參考熒光蛋白與標(biāo)記熒光蛋白在光學(xué)成像上互不干擾。

2.如權(quán)利要求1所述的雙分子熒光互補(bǔ)標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記熒光蛋白選自但不限于下列熒光蛋白中的一種：黃色熒光蛋白Venus、YFP和Citrine、青色熒光蛋白CFP和Cerulean、紅色熒光蛋白mCherry以及光轉(zhuǎn)化熒光蛋白mEos3.2。

3.如權(quán)利要求1所述的雙分子熒光互補(bǔ)標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，所述參考熒光蛋白選自但不限于下列熒光蛋白中的一種：紅色熒光蛋白mCherry、藍(lán)色熒光蛋白BFP、綠色熒光EGFP、紅色熒光蛋白miRFP670、miRFP670nano和miRFP703。

4.如權(quán)利要求1所述的雙分子熒光互補(bǔ)標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記熒光蛋白是黃色熒光蛋白Venus，其N(xiāo)端片段是Venus蛋白的第1-172氨基酸殘基組成的肽段，其C端片段是Venus蛋白的第155-238氨基酸殘基組成的肽段。

5.一種能夠有效識(shí)別假陽(yáng)性信號(hào)的熒光標(biāo)記方法，包括以下步驟：

1)基于雙分子熒光互補(bǔ)標(biāo)記系統(tǒng)，構(gòu)建標(biāo)記熒光蛋白的N端片段和C端片段，分別命名為FP_N和FP_C；

2)選擇在光學(xué)成像上與標(biāo)記熒光蛋白互不干擾的另一個(gè)熒光蛋白作為參考熒光蛋白，命名為REF_FP；

3)構(gòu)建待測(cè)蛋白A-FP_N-REF_FP融合表達(dá)的第一載體，和待測(cè)蛋白B-FP_C融合表達(dá)的第二載體；或者，構(gòu)建待測(cè)蛋白A-FP_N融合表達(dá)的第一載體，和待測(cè)蛋白B-FP_C-REF_FP融合表達(dá)的第二載體；

4)用步驟3)構(gòu)建的第一載體和第二載體轉(zhuǎn)染活細(xì)胞；

5)對(duì)轉(zhuǎn)染后活細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡成像，計(jì)算標(biāo)記熒光蛋白與參考熒光蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度比值，檢測(cè)假陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)弱。

6.如權(quán)利要求5所述的熒光標(biāo)記方法，其特征在于，步驟1)中所述標(biāo)記熒光蛋白選自但不限于下列熒光蛋白中的一種：黃色熒光蛋白Venus、YFP和Citrine、藍(lán)色熒光蛋白CFP和Cerulean、紅色熒光蛋白mCherry以及光轉(zhuǎn)化熒光蛋白mEos3.2；步驟2)中所述參考熒光蛋白選自但不限于下列熒光蛋白中的一種：紅色熒光蛋白mCherry、藍(lán)色熒光蛋白BFP、綠色熒光EGFP、紅色熒光蛋白miRFP670、miRFP670nano和miRFP703。

7.如權(quán)利要求5所述的熒光標(biāo)記方法，其特征在于，步驟1)構(gòu)建黃色熒光蛋白Venus的由第1-172氨基酸殘基組成的N端片段和由第155-238氨基酸殘基組成的C端片段；步驟2)以紅色熒光蛋白mCherry作為參考熒光蛋白；步驟3)將參考熒光蛋白與標(biāo)記熒光蛋白的N端片段或C端片段連接形成融合蛋白。

8.如權(quán)利要求5所述的熒光標(biāo)記方法，其特征在于，在步驟5)中，以F_FP代表標(biāo)記熒光蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度，以F_{REF_FP}代表參考熒光蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度，則二者熒光信號(hào)強(qiáng)度的比值F_FP/F_{REF_FP}作為識(shí)別假陽(yáng)性信號(hào)的參數(shù)。