[發(fā)明專利]一種用于重組表達(dá)棘白菌素B脫酰基酶的表達(dá)盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110437554.8
• 申請(qǐng)日: 2021-04-22
• 公開（公告）號(hào): CN113174398B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳志強(qiáng);鄒樹平;鄭裕國(guó);牛坤;韓鑫;朱寒悅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;C12N9/80;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發(fā)明公開了一種用于重組表達(dá)棘白菌素B脫酰基酶的表達(dá)盒及應(yīng)用，所述表達(dá)盒包括依次連接的啟動(dòng)子核酸序列、RBS核酸序列、編碼OmpA信號(hào)肽的核酸序列、編碼第一促溶肽的核酸序列、編碼棘白菌素B脫酰基酶α亞基的核酸序列、第一終止密碼子、RBS核酸序列、編碼OmpA信號(hào)肽的核酸序列、編碼棘白菌素B脫酰基酶β亞基的核酸序列、編碼第二促溶肽的核酸序列、第二終止密碼子，其中，第一促溶肽的氨基酸序列為：GEGEG；第二促溶肽的氨基酸序列為：KKKKKK。本發(fā)明表達(dá)盒能夠用于表達(dá)獲得棘白菌素B脫酰基酶，通過(guò)兩種特定序列促溶肽的加入，使得棘白菌素B脫酰基酶能夠有效且高效表達(dá)，發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌體破碎后酶活可高達(dá)57.88U/g。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于重組表達(dá)棘白菌素B脫酰基酶的表達(dá)盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)

真菌感染是指由真菌微生物引起的感染。近年來(lái)，真菌感染造成的死亡人數(shù)不斷增多，其原因與皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性藥物、光譜抗生素及免疫抑制劑等在臨床中的廣泛應(yīng)用有關(guān)。棘白菌素類藥物作為與細(xì)胞壁合成酶作用的抑制劑普遍存在抗菌活性強(qiáng)，與其他藥物不存在拮抗作用等特點(diǎn)，其中尤以阿尼芬凈最為突出，其具有較大的分布容積和光譜抗菌性，不經(jīng)肝臟代謝，不存在交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，而生物法催化生產(chǎn)阿尼芬凈前體已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外抗真菌藥物研究的熱點(diǎn)。

Echinocandin B脫酰基酶(ECBD)能夠通過(guò)裂解亞油酰基側(cè)鏈來(lái)催化Echinocandin B(ECB)向環(huán)狀六肽棘皮菌素B核(ECBN)的轉(zhuǎn)化，這是半合成新型抗真菌藥物阿尼芬凈(anidulafungin)的關(guān)鍵中間體。Echinocandin B脫酰基酶(ECBD)屬于N末端親核酶(Ntn)水解酶超家族，其前體由信號(hào)肽(SP)，α亞基，連接肽(LP)和β亞基組成。

亞基重構(gòu)(Subunit reconsititution)是指針對(duì)多亞基蛋白的一種結(jié)構(gòu)域再安排，與循環(huán)排列類似(Circular permutation)，多見于抗體基因在大腸桿菌中的表達(dá)，由于在目的基因中含有內(nèi)含子或連接肽等無(wú)功能活性的基因，將原本單鏈多亞基的蛋白利用基因工程的方法將其獨(dú)立表達(dá)后再利用蛋白的自組裝形成活性結(jié)構(gòu)域，該過(guò)程本身不會(huì)導(dǎo)致對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)序列的任何氨基酸取代，而只是重組了多肽鏈中殘基的順序。而且此方法規(guī)避了單鏈多亞基蛋白在大腸桿菌中復(fù)雜的成熟過(guò)程，更有利于擁有復(fù)雜基因結(jié)構(gòu)的蛋白在大腸桿菌中的成功表達(dá)。

近幾年來(lái)，棘白菌素B脫酰基酶的異源表達(dá)宿主主要為鏈霉菌，如變鉛青鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌等。但是鏈霉菌的基因分子操作很不便利，可供使用的載體與改造方法也有限(如更換質(zhì)粒的拷貝數(shù)、更換強(qiáng)啟動(dòng)子與信號(hào)肽等方法)。而且其發(fā)酵周期與代謝調(diào)控與大腸桿菌相比復(fù)雜很多。

在通過(guò)亞基重構(gòu)(Subunit reconsitituion)解決了單鏈多亞基蛋白在大腸桿菌中復(fù)雜的成熟過(guò)程后，成功將棘白菌素B脫酰基酶大腸桿菌中的活性表達(dá)。但是其活性與可溶性并不理想。大量的包涵體在周質(zhì)空間內(nèi)聚集，無(wú)活性的蛋白甚至對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的阻礙。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提供了一種用于重組表達(dá)棘白菌素B脫酰基酶的表達(dá)盒及應(yīng)用。

一種用于重組表達(dá)棘白菌素B脫酰基酶的表達(dá)盒，包括依次連接的啟動(dòng)子核酸序列、RBS核酸序列、編碼OmpA信號(hào)肽的核酸序列、編碼第一促溶肽的核酸序列、編碼棘白菌素B脫酰基酶α亞基的核酸序列、第一終止密碼子、RBS核酸序列、編碼OmpA信號(hào)肽的核酸序列、編碼棘白菌素B脫酰基酶β亞基的核酸序列、編碼第二促溶肽的核酸序列、第二終止密碼子，

其中，第一促溶肽的氨基酸序列為：GEGEG；第二促溶肽的氨基酸序列為：KKKKKK。