[發明專利]黑脂大小蠹的實時熒光PCR檢測方法及檢測用引物和探針

在審

• 申請號: 202110437077.5
• 申請日: 2021-04-22
• 公開（公告）號: CN113025727A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 劉嘉歡;孟瑞;蔡波;敖蘇;徐衛;劉福秀;韓玉春;陳施明;王安石
• 申請（專利權）人: 海口海關熱帶植物隔離檢疫中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 西安鼎邁知識產權代理事務所(普通合伙) 61263
• 代理人: 馮新飛

本發明提供了一種黑脂大小蠹的檢測方法，經試驗篩選的特異性引物(Hei?F和Hei?R)和探針(Hei?P)組合在Taq?Man實時熒光定量PCR方法中可達到鑒定黑脂大小蠹的目的。本發明適用于不同狀態大小蠹的檢疫鑒定，彌補了常規形態學鑒定方法的不足，與現有技術中運用的DNA條形碼鑒定技術相比，引物和MGB探針特異性強、靈敏度高、實驗操作簡單、用時短；鑒定結果直觀，觀察擴增曲線即可得出結果。本研究不但能滿足進出境原本的快速通關的要求，提高檢出率，同時能夠有效預防危險性大小蠹的入侵和擴散，對保護我國農林業生產和生態安全具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物物種分子鑒定技術領域，涉及一種大小蠹的實時熒光PCR檢測方法，具體涉及黑脂大小蠹的檢測方法及其應用；此外，本發明還涉及檢測黑脂大小蠹的引物和探針。

背景技術

大小蠹屬Dendroctonus屬于鞘翅目Coleoptera、象甲科Curculionidae、小蠹亞科Scolytinae，是一類重要的森林生態系統蛀干害蟲，其主要對松屬、云杉屬、黃杉屬等林木造成危害，該屬(非中國種)已被列入我國進境植物檢疫性有害生物名錄。全世界大小蠹屬已知共20種，其中中、北美洲分布18種，歐洲、亞洲現分布3種。大小蠹屬非中國種害蟲，黑脂大小蠹Dendroctonus terebrans原產于美國，不僅是危害松杉類針葉樹種的蛀干害蟲，而且傳播藍霉菌，破壞傳播水分的木質部，造成樹木死亡。隨著我國對外貿易的日益頻繁，進口木材數量與日俱增，口岸截獲的害蟲種類和數量不斷增加，故對其進行快速準確的檢疫鑒定對預防檢疫性種類入侵有重要的意義。

目前針對大小蠹屬種類，基于外部形態特征進行鑒定仍是檢疫系統最常用的方法。然而，形態學鑒定主要以成蟲為研究對象，口岸截獲的大小蠹中有相當一部分為幼蟲，蛹或者部分破碎的成蟲，使得形態學鑒定難以實現準確鑒定。不僅如此，大小蠹屬害蟲的種間形態相似，差異較小，鑒定較為困難，對鑒定人員經驗和分類基礎要求較高。因此，探索新的方法彌補形態鑒定的不足顯得尤為重要和迫切。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，如DNA條形碼技術、常規PCR檢測技術、實時熒光定量PCR檢測技術、限制性片段長度多態性(RFLP)技術及微衛星技術等多種技術逐漸應用于物種的分子鑒定方法當中。但國內對于大小蠹的分子鑒定技術研究報道仍舊較少，殷玉生等基于線粒體COI基因對我國口岸經常截獲的6種大小蠹屬昆蟲快速鑒定的可行性和準確性進行了研究(詳見：殷玉生，張帆，安榆林.基于線粒體COI基因鑒定大小蠹屬昆蟲[J].福建林業科技，2014，41(01)：63-67.)；花婧等通過線粒體COI基因867bp片段序列對大小蠹屬17個種類進行序列分析，表明COI基因可作為大小蠹屬昆蟲分類的依據(詳見：花婧，鄭斯竹，安榆林，楊曉軍.基于線粒體COⅠ基因的大小蠹屬昆蟲DNA條形碼研究[J].江蘇農業科學，2014，42(03)：30-32.)；田虎等基于DNA條形碼技術表明mtDNA COI基因5'端和3'端序列均可有效區分紅翅大小蠹與黑脂大小蠹(詳見：田虎，于培文，婁巧哲，徐志彬，楊曉麗，王新軍，郝常，郭揚振.基于DNA條形碼的紅翅大小蠹和黑脂大小蠹分子鑒定[J].植物檢疫，2020，34(01)：30-34.)。但目前大小蠹分子鑒定尚未進行實時熒光PCR快速鑒定技術研究。