[發明專利]黑脂大小蠹的實時熒光PCR檢測方法及檢測用引物和探針

在審

• 申請號: 202110437077.5
• 申請日: 2021-04-22
• 公開（公告）號: CN113025727A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 劉嘉歡;孟瑞;蔡波;敖蘇;徐衛;劉福秀;韓玉春;陳施明;王安石
• 申請（專利權）人: 海口海關熱帶植物隔離檢疫中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 西安鼎邁知識產權代理事務所(普通合伙) 61263
• 代理人: 馮新飛

1.黑脂大小蠹的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)設計引物和探針；

(2)提取黑脂大小蠹基因組DNA；

(3)采用步驟(1)中引物進行實時熒光PCR檢測，根據結果區分黑脂大小蠹和其他檢疫性大小蠹昆蟲。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(1)所述的引物包括上游引物和下游引物，

所述上游引物Hei-F序列為：5'-GATTGGTCCCATTAATACTAGG-3'；

所述下游引物Hei-R序列為：5'-GCTAACACTGGCAGAGACAAT-3'。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(1)所述探針的引物Hei-P序列為：5'-CAGGAATCTCTTCTATTC-3'。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述探針引物的5'端連接熒光基團FAM，3'端連接非熒光猝滅基團。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)的具體實施方法為：取供試黑脂大小蠹標本足或頭胸部肌肉組織，進行基因組DNA的提取。

6.根據權利要求1所述的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述實時熒光PCR檢測方法的反應體系組分包括：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)10μL、上游引物Hei-F(10μM)0.4μL、下游引物Hei-R(10μM)0.4μL、探針Hei-P(10μM)0.8μL、ROX Reference DyeII(50×)0.2μL、DNA模板2μL、滅菌水6.2μL。

7.根據權利要求1所述的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述實時熒光PCR檢測方法的反應程序為：95℃預變性30sec，95℃變性5sec，59℃退火30sec，變性-退火兩個過程重復35個循環。

8.根據權利要求1所述的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述試劑盒包括引物和探針，所述引物和探針如下：

上游引物Hei-F序列為：5'-GATTGGTCCCATTAATACTAGG-3'；

下游引物Hei-R序列為：5'-GCTAACACTGGCAGAGACAAT-3'；

探針引物Hei-P序列為：5'-CAGGAATCTCTTCTATTC-3'；

所述探針引物的5'端連接熒光基團FAM，3'端連接非熒光猝滅基團。

9.權利要求1至8任一項所述黑脂大小蠹的實時熒光PCR檢測方法在木材有害生物檢疫中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述檢測方法用于松屬Pinus類木材有害生物的檢疫。