[發(fā)明專利]用于分散生物組織的酶試劑盒和使用其獲得單細胞懸液的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110436874.1
• 申請日: 2021-04-22
• 公開（公告）號: CN113388599B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李相堯;吳橙;劉麗;盛濤;王菁華;連艷娜
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N9/52;C12N9/22;C12N5/079
• 代理公司: 上海上谷知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31342
• 代理人: 蔡繼清

1.一種獲得單細胞懸液的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

使用用于分散生物組織的酶試劑盒獲得單細胞懸液，所述用于分散生物組織的酶試劑盒包括：第一試劑和第二試劑，所述第一試劑包括鏈霉蛋白酶，所述第二試劑中包括木瓜蛋白酶；

（1）將待分離的組織碎片分成兩份，其中一份使用所述第一試劑進行消化，獲得第一消化液，另一份使用所述第二試劑進行消化，獲得第二消化液；

（2）取步驟（1）中所得第一消化液和第二消化液置于同一HAG培養(yǎng)基中混合，并進行分散，吸取上清液，即獲得所述單細胞懸液；

其中，每毫升所述第一試劑中，包括：

DNA酶 (0.5~1.4)V/V%，

10% 牛血清蛋白 (5.0~14.0) V/V %，

鏈霉蛋白酶 (0.5~5.0) mg/mL；

和/或，

每毫升所述第二試劑中包括：

DNA酶 (0.5~1.4) V/V %，

10% 牛血清蛋白 (5.0~14.0) V/V %，

木瓜蛋白酶 (0.5~5.0) mg/mL；

其中，所述生物組織為哺乳動物腦組織或耳蝸前庭組織。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用獲得單細胞懸液的方法，其特征在于，所述第一試劑還包括HAG培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用獲得單細胞懸液的方法，其特征在于，所述第二試劑還包括HAG培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用獲得單細胞懸液的方法，其特征在于，所述步驟（2）后還包括步驟（3）：取步驟（2）所得的上清液使用細胞篩過濾處理，收集濾液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用獲得單細胞懸液的方法，其特征在于，所述步驟（3）后還包括步驟（4）：取所步驟（3）所得的濾液進行梯度離心，收集下層細胞，置于液體介質(zhì)中混勻。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的使用獲得單細胞懸液的方法，其特征在于，所述步驟（4）中還包括步驟（5）：取步驟（4）中于液體介質(zhì)中混勻的細胞，使用細胞篩過濾處理，收集濾液，離心棄掉上清，將所得細胞在液體介質(zhì)中混勻。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用獲得單細胞懸液的方法，其特征在于，步驟（1）中，組織碎片和第一試劑的加入量為每毫升第一試劑中加入組織碎片0.03~0.1g；

和/或，步驟（1）中，組織碎片和第二試劑的加入量為每毫升第一試劑中加入組織碎片0.03~0.1g；

和/或，步驟（1）中，所述消化在恒溫搖床上進行；

和/或，步驟（1）中，所述消化的時間為15~30 min；

和/或，步驟（2）中，所述第一消化液和第二消化液的總體積與HAG培養(yǎng)基的體積比為1:(0.7~2)；

和/或，步驟（2）中，所述分散的方式為使用氣槍吹散細胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用獲得單細胞懸液的方法，其特征在于，

和/或，步驟（5）中，依次使用70 um、40 um和10 um的細胞篩進行三次過濾處理；

和/或，步驟（5）中，所述離心的次數(shù)大于1次。