[發明專利]HBB基因CD17突變細胞及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202110436779.1
• 申請日: 2021-04-22
• 公開（公告）號: CN113201499A
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 孫筱放;程怡;何麗娜;宋兵;楊影虹
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬第三醫院（廣州重癥孕產婦救治中心;廣州柔濟醫院）
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/90;C12N15/864;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中

本發明涉及細胞生物學領域，具體而言，涉及一種HBB基因CD17突變細胞及其制備方法與應用。所述方法包括：i)使用RNP復合體靶向切割細胞的基因組DNA的HBB基因，所述RNP復合體包括sgRNA和Cas9蛋白；ii)使用含有CD17A＞T突變位點位的外源DNA與處理后的基因組DNA進行同源介導修復。本發明可以提供一種攜帶HBB基因CD17A＞T突變的細胞，引起的β?珠蛋白表達缺陷所構建的β?地中海貧血細胞株的方法，有助于疾病的臨床治療和再生醫學研究。

技術領域

本發明涉及細胞生物學領域，具體而言，涉及一種HBB基因CD17突變細胞及其制備方法與應用。

背景技術

β-地中海貧血(β-thalassemia)是最常見的單基因遺傳病，且分布范圍廣泛，是遍布全球的遺傳性疾病之一。這種病的主要致病機制是β-珠蛋白合成障礙，β-珠蛋白表達量缺乏或嚴重減少，使α/β-珠蛋白鏈比率失衡，不能合成具有正常生物功能的血紅蛋白四聚體，造成貧血。嚴重的β-地中海貧血患者體內無效的紅細胞生成增多，出現慢性溶血性貧血，代償性造血機制被激活，代償性造血功能亢進，出現在骨髓以外的造血點，如肝臟或脾臟，也可以出現在具有造血潛力的任何器官組織，會增加髓外假性腫瘤形成的風險。在無效紅系細胞生成的過程中，紅系細胞暴露于衰老抗原如磷脂酰絲氨酸，使其容易形成血栓。地中海貧血患者常出現血小板和凝血系統異常，血液呈高凝狀態，且出現相關的血管臨床癥狀如靜脈血栓和肺動脈高壓等，特別是脾切除的患者。此外，無效紅細胞生成導致鐵吸收增加，出現由肝臟激素介導的原發性鐵超負荷。或由于長期輸血引起的鐵沉積，可使臨床表型進一步復雜化，累及多個器官系統。β-地中海貧血純合子患者依賴于定期輸血和鐵螯合劑生存。一個多世紀以來，β-地中海貧血一直是研究的重點，雖然其遺傳學分子機制已經得到明確的探討，但β-地中海貧血的治療策略在很大程度上仍然只是降低臨床癥狀的嚴重性，主要治療手段是定期輸血。目前，唯一可使患者痊愈的治療方法是造血干細胞移植。然而大多數β-地中海貧血患者無法獲得人類白細胞抗原匹配的供體，且患者使其面臨著嚴重的異體移植排斥反應，以及免疫抑制手段帶來的感染性并發癥的風險。

β-地中海貧血的致病基因HBB通常為單個堿基突變或幾個堿基的缺失，極少發生大片段缺失，堿基突變常發生在1號外顯子區，1號內含子區和2號外顯子區，2號內含子區。現有的根治方案是骨髓移植，但骨髓移植存在來源范圍窄、配型限制、供體不足等困難之處。因此近幾十年研究者們之前致力尋找可替代骨髓移植的β-地中海貧血的治療方法，如有研究采用攜帶HBB基因的過表達類型慢病毒進行HBB基因的過表達，讓β-珠蛋白表達水平上升，或CRISPR-Cas9基因編輯技術加上寡核苷酸單鏈誘導HDR發生的方式，進行HBB基因單個突變位點或幾個堿基的缺失的修復，從而達到在細胞或動物模型中讓β-珠蛋白表達量上升達到緩解疾病表型的目的，但是在這些研究過程中，關于地貧細胞模型的獲取主要來源是地貧病人的造血干細胞，即CD34⁺細胞，這種細胞的獲取存在如下問題：1、涉及倫理問題；2、取樣過程對人體造成創傷；3、造血干細胞體外培養過程最長只能維持21天，不能進行長期的實驗處理或實驗觀察，不是非常理想的細胞研究工具；4、由于產前診斷的發展，重型β-地貧患者的出生率得到很好的控制，病人數量有限。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明旨在克服現有技術的缺點和不足，提供一種相對簡易可行的構建β-地中海貧血CD17 A＞T模型細胞株，為后續β-地中海貧血治療或藥物篩選提供可靠細胞實驗模型的方法。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

本發明的第一方面涉及制備HBB基因CD17突變細胞的方法，包括：

i)使用RNP復合體靶向切割細胞的基因組DNA的HBB基因，所述RNP復合體包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA和Cas9蛋白；

ii)使用含有CD17 A＞T突變位點位的外源DNA與處理后的基因組DNA進行同源介導修復。