[發(fā)明專利]HBB基因CD17突變細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110436779.1
• 申請(qǐng)日: 2021-04-22
• 公開（公告）號(hào): CN113201499A
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫筱放;程怡;何麗娜;宋兵;楊影虹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（廣州重癥孕產(chǎn)婦救治中心;廣州柔濟(jì)醫(yī)院）
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/90;C12N15/864;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中

1.制備HBB基因CD17突變細(xì)胞的方法，其特征在于，包括：

i)使用RNP復(fù)合體靶向切割細(xì)胞的基因組DNA的HBB基因，所述RNP復(fù)合體包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA和Cas9蛋白；

ii)使用含有CD17 A＞T突變位點(diǎn)位的外源DNA與處理后的基因組DNA進(jìn)行同源介導(dǎo)修復(fù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源DNA通過rAAV遞送至所述細(xì)胞以進(jìn)行同源介導(dǎo)修復(fù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述rAAV血清型是Ⅵ號(hào)血清型。

4.根據(jù)權(quán)利1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述外源DNA的核苷酸序列為SEQ IDNO:2所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNP復(fù)合體中，所述sgRNA與所述Cas9蛋白的摩爾比為(2～3):1。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述sgRNA與所述Cas9蛋白以電轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入所述細(xì)胞，轉(zhuǎn)染體系中比例，1nmol Cas9蛋白對(duì)應(yīng)(0.5～1.5)×10⁵個(gè)所述細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，電轉(zhuǎn)的條件為1500V～1700V，8ms～12ms，2pulse～4pulse。

8.根據(jù)權(quán)利要求1～3、5～7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為紅系細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為HUDEP-2細(xì)胞。

10.權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)方法制備得到的HBB基因CD17突變細(xì)胞。

11.權(quán)利要求10所述的HBB基因CD17突變細(xì)胞在鑒別和/或測(cè)試藥物中的用途；

所述藥物用于預(yù)防和/或治療β-地中海貧血和/或β-地中海貧血相關(guān)的并發(fā)癥。

12.組合產(chǎn)品，其特征在于，包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA、Cas9蛋白或編碼其的核酸片段，以及含有CD17 A＞T突變位點(diǎn)位的外源DNA。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合產(chǎn)品，其特征在于，所述外源DNA包裝于Ⅵ號(hào)血清型rAAV中。