[發明專利]一種酸性蛋白酶高效表達的方法及其應用

有效

• 申請號: 202110436308.0
• 申請日: 2021-04-22
• 公開（公告）號: CN112920280B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 吳丹;鄭璞;陳鵬程;魏夢園
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/58;C12N9/64;C12N15/62;C12N15/81;C12N1/19;C12G1/022;C12R1/84;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明公開了一種酸性蛋白酶高效表達的方法及其應用，屬于基因工程領域。本發明提供的重組畢赤酵母P.pastorisGS115/pPIC9K?en?αSP?acidprotea表達酶活達到5395U/mL，較含有原始α?信號肽的對照菌株產酶酶活提高了109％，本發明的酸性蛋白在pH1?5范圍內，該酶能夠維持其60％以上的酶活力、20～40℃處理30min剩余酶活在80％以上，可適用于食品、飼料或釀造等行業。根據本發明的技術方案可以實現利用基因工程手段生產適合工業應用的酸性蛋白酶。

技術領域

本發明涉及一種酸性蛋白酶高效表達的方法及其應用，屬于基因工程領域。

背景技術

蛋白酶是催化蛋白質水解的一類酶，其在植物、動物和微生物中都有廣泛存在。相比于動植物來源的蛋白酶，微生物源蛋白酶，具有培養方便、操作簡單和產酶量高的特點，便于工業化的批量生產得以大規模生產應用。因此，微生物源蛋白酶成為了目前的蛋白酶的重要來源。

蛋白酶的分類方式有很多，按照蛋白酶作用的pH，將其分成酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶。酸性蛋白酶通常在pH 2.0～6.0之間是穩定的，最適pH值隨種屬不同稍有不同，但通常都在pH 3.0左右，如真菌所產酸性蛋白酶的最適pH為3.0，灰綠青霉菌為pH3.5，酵母菌也在pH 3.0。該類酶擁有較高的序列似性，其三維結構呈對稱的雙葉型。按活性中心的不同，蛋白酶分為：絲氨酸蛋白酶、天門冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。

酸性蛋白酶在食品、釀造、毛皮與皮革、醫藥和飼料等行業中均有廣泛應用。白酒釀造的發酵過程中，利用酸性蛋白酶起協同作用，溶解發酵原料的顆粒，提高原材料的利用率，促進微生物生長，分解蛋白質提供生香前體物質和風味物質，分解酵母菌體蛋白。在毛皮、皮革的制造過程中，酸性蛋白酶將纖維間質除去，使皮質更加柔軟、豐滿。飼料行業中，酸性蛋白酶的添加可提高蛋白質的可消化性，使高分子的蛋白質降解為低分子的肽及氨基酸，易于畜禽消化吸收，可降低飼料對幼仔消化道的刺激，減少營養障礙，提高飼料利用率，促進畜禽生長。

現有技術中，野生酸性蛋白酶性能拙劣、產量低下，遠遠不能滿足市場需求，因此，它很難被真正應用于工業化生產中。現在，常常采用構建基因工程菌的手段，強化酸性蛋白酶基因的轉錄和翻譯，以提高酸性蛋白酶的產量。

目前用于工業化生產的酸性蛋白酶大多為霉菌酸性蛋白酶，此類酶的最適作用pH生長值為3.0左右，當pH值升高時，酸性蛋白酶的酶活會明顯降低，且此類酶不耐熱，當溫度達到50℃以上時很不穩定。因此，酸性蛋白酶的酶活不高，酶自身最適作用條件與所催化的環境條件之間在pH、溫度等方面的差別，導致酶的催化效率降低，從而限制了酸性蛋白酶在工業中的應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種酸性蛋白酶高效表達的方法。

本發明的第一個目的是提供一種融合蛋白，所述融合蛋白為N端連接有增強型α-信號肽的酸性蛋白酶；所述酸性蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述增強型α-信號肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一種實施方式中，所述酸性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述增強型α-信號肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明的第二個目的是提供表達所述融合蛋白的載體。

本發明的第三個目的是提供含有所述融合蛋白或載體的重組菌株。

在一種實施方式中，所述重組菌株以畢赤酵母Pichia.pastoris為宿主。

在一種實施方式中，所述重組菌株以pPIC9K為載體。

在一個實施方式中，所述宿主畢赤酵母是GS115、KM71和X33。