[發(fā)明專利]一種產(chǎn)唾液酸乳糖的重組宿主菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110433652.4
• 申請日: 2021-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN113151133B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳金勇;李忠奎;陳祥松;袁麗霞;王紀(jì);王煜;王剛;孫立潔;李翔宇;姚建銘
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院;武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N15/31;C12P19/26;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發(fā)明涉及代謝工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)唾液酸乳糖的重組宿主菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建的產(chǎn)唾液酸乳糖的重組宿主菌過表達(dá)pyrG基因和/或串聯(lián)過表達(dá)一個(gè)或多個(gè)拷貝數(shù)的cmk和ppk基因。本發(fā)明通過輔因子CTP的再生或者過表達(dá)CTP合成酶基因提高細(xì)胞內(nèi)的底物輔因子的供應(yīng)，無需外源性的添加輔因子，降低生產(chǎn)成本，并且還可以利用不同拷貝數(shù)的表達(dá)載體串聯(lián)表達(dá)cmk和ppk基因，優(yōu)化底物CTP含量，實(shí)現(xiàn)唾液酸乳糖產(chǎn)量的提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及代謝工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種產(chǎn)唾液酸乳糖的重組宿主菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

人乳寡糖（HMOs）是人類母乳中僅次于乳糖和脂肪的第3大固體組分，不僅種類多，且含量較高，特別是在分娩后的初乳中，有著牛乳、羊乳等其他動(dòng)物的母乳遠(yuǎn)所不如的寡糖含量。現(xiàn)已證實(shí)，HMOs具有效益生元作用，可以選擇性刺激腸道內(nèi)有益菌的生長，間接抑制有害菌的生長，維持腸道微生態(tài)平衡，從而最大限度地降低消化道疾病的發(fā)生，進(jìn)而改善宿主嬰兒的健康狀況，這種循序漸進(jìn)、立體和全方位的保護(hù)兼培養(yǎng)性功能，為新生兒消化系統(tǒng)的發(fā)育和成熟提供了寶貴的時(shí)間和良好的環(huán)境。唾液酸寡糖就是含有一個(gè)或若干個(gè)唾液酸分子的一類寡糖化合物，廣泛分布在各種生物組織中，具有重要的生物信息傳遞等功能。同時(shí)作為HMOs中最主要的兩種寡糖組成之一，唾液酸寡糖也表現(xiàn)出了獨(dú)特的生理活性和優(yōu)越的市場潛力。HMOs中唾液酸寡糖的主要存在形式有兩種：3’-SL和6’-SL，他們分別由α-2,3和α-2,6唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶催化一分子唾液酸和一分子乳糖脫水縮合而成。

目前關(guān)于發(fā)酵法制備唾液酸乳糖，國內(nèi)外已有相關(guān)專利和文獻(xiàn)公布。根據(jù)發(fā)酵底物的不同，主要分為補(bǔ)救路徑和從頭合成路徑。在補(bǔ)救路徑中是以唾液酸和乳糖為合成底物制備唾液酸乳糖，2002年Eric?Samain使用補(bǔ)救合成路徑，以E.coli?JM107為宿主，敲除NeuAc醛縮酶基因（ nanA）和β-半乳糖苷酶基因（ lacZ）,過表達(dá)CMP-NeuAc合成酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶，以唾液酸和乳糖為合成底物，甘油為碳源進(jìn)行發(fā)酵，可生成2.6g/L?3’-唾液酸乳糖。2008年Eric?Samain以從頭合成路徑制備3’-唾液酸乳糖（圖2），通過敲除NeuAc轉(zhuǎn)運(yùn)子（ nanT），NeuAc醛縮酶基因（ nanA），N-乙酰甘露糖胺激酶基因（ nanK），N-乙酰甘露糖胺-6-6磷酸差向異構(gòu)酶基因（ nanE），過表達(dá)乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（ neuB），CMP-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（ neuA），N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶基因（ neuC）以及a-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，以乳糖為合成底物，甘油作為碳源發(fā)酵制備3’-唾液酸乳糖，可生成25.5g/L?3’-唾液酸乳糖。2010年Eric?Samain課題組同樣以從頭合成構(gòu)建6’-唾液酸乳糖路徑，僅將3’-唾液酸乳糖從頭合成路徑中的a-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶更改為a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，發(fā)酵獲得34g/L?6’-唾液酸乳糖。