[發明專利]KRAS基因突變的檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202110432225.4
• 申請日: 2021-04-21
• 公開（公告）號: CN113005183A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 吳亞;邱宇;鄧魏鑫;王維旭;張喆
• 申請（專利權）人: 武漢友芝友醫療科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 易賢衛

本發明公開了一種KRAS基因突變的檢測試劑盒及其應用，包括：突變位點的特異性上游引物、下游引物和雙淬滅探針；其中所述的特異性上游引物的從5’端到3’端依次為：捕獲區：長度為12?21bp，與目的片段完全配對；錯配識別區：長度為3?6bp，與目的片段錯配；突變保護區：包含突變識別位點，以及與所述突變識別位點配對形成發卡結構的3’端；下游引物與KRAS基因突變位點的下游配對；雙淬滅探針上帶有兩個淬滅基團。本發明通過對上游引物進行特殊設計，并與雙淬滅探針結合，顯著提高了檢測靈敏度和特異性，可兼容組織和血漿兩種樣本類型，滿足臨床需求，同時操作過程簡單快速，檢測結果簡單直觀。

技術領域

本發明屬于基因突變檢測技術領域，具體涉及KRAS基因突變的檢測試劑盒及其應用。

背景技術

RAS基因家族與人類腫瘤密切相關的基因有三種HRAS、KRAS和NRAS，這三種基因編碼的蛋白質有約90％的氨基酸序列同源，又稱為RASp21蛋白。KRAS信號通路是EGFR和其他信號轉導的下游通路，當RAS基因發生突變時，其編碼的RAS蛋白水解GTP-RAS能力下降，使得信號轉導通路一直處于持續激活狀態，刺激細胞不斷增殖分化，最終導致細胞惡變。KRAS突變基因是一種常見的致癌基因，多見于惡性腫瘤，結直腸癌患者中約有30％～40％存在KRAS基因突變，肺腺癌患者中約有15％～30％存在KRAS突變。

研究表明，KRAS基因突變與NSCLC對吉非替尼、厄洛替尼等靶向治療藥物的原發性耐藥有關。有研究發現KRAS基因的突變使結直腸癌患者對西妥昔單抗的治療產生耐藥性，NCCN(非小細胞肺癌臨床實踐指南2016版)指出KRAS基因突變會使肺癌患者對EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFT-TKI)產生耐藥，使結直腸癌患者對抗EGFR抗體類藥物產生耐藥。因此對KRAS基因突變進行風險預測，是EGFR靶向治療耐藥性產生與否的重要預測指標。

目前臨床檢測DNA中基因突變的方法主要有：1)直接測序法，是目前應用最多的一種檢測方法，主要是Sanger測序，當突變基因得到有效富集之后，才能被測序，在突變基因含量低的情況下檢測不準確，即靈敏度低。2)高通量測序技術法，但其富集特異性和有效性在不同的實驗平臺差距大，并且建庫流程繁雜，周期長，成本高。3)常規的ARMS-PCR法：其靈敏度只能穩定達到1％突變檢測，但血漿樣本中游離的DNA往往碎片化并且總量非常少，導致需要采集的血液樣本量過大，對患者傷害較大且操作繁瑣。目前臨床上推薦采集患者5-10ml全血用于后續檢測，即所提取的游離DNA濃度有限，因此亟需一種靈敏度更高，能夠兼容組織和血漿這兩種樣本類型的檢測方法和檢測試劑盒。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種KRAS基因突變的檢測試劑盒及其應用，通過對熒光PCR檢測上游引物進行特殊設計，提高了識別效率和特異性，進一步將該引物與雙淬滅探針結合，顯著提高了引物探針與靶標片段的結合能力，提高了檢測的擴增效率和信號值，以滿足血檢的高靈敏度高特異性要求，可兼容組織和血漿兩種樣本類型并同時檢測KRAS基因7種類型的突變，而且操作過程簡單快速，成本低，檢測結果清晰明了易分析。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

本發明提供了一種KRAS基因突變的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒中包括：突變位點的特異性上游引物、下游引物和雙淬滅探針；

其中所述的特異性上游引物結構依次為：捕獲區：長度為12-21bp，與目的片段完全配對；錯配識別區：長度為3-6bp，與目的片段錯配；突變保護區：包含突變識別位點，以及與所述突變識別位點配對形成發卡結構的3’端；

所述下游引物與KRAS基因突變位點的下游配對；

所述雙淬滅探針上帶有兩個淬滅基團。