[發(fā)明專利]一種橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3及其克隆與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110431093.3
• 申請日: 2021-04-21
• 公開（公告）號: CN112980847B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 辛士超;戴雪梅;黃天帶;吉努烏達(dá)亞巴努;華玉偉;楊先鋒;黃華孫
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/84;C12N15/66;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/38
• 代理公司: 北京興智翔達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11768
• 代理人: 郭衛(wèi)芹

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種橡膠樹內(nèi)源組成型啟動子，更具體涉及一種橡膠樹泛素基因的啟動子proHbUBI3，并進(jìn)一步公開其克隆方法及應(yīng)用。本發(fā)明方案通過核苷酸序列比對在巴西橡膠樹基因組中篩選得到高度保守的橡膠樹泛素基因，并進(jìn)一步通過克隆HbUBI3基因起始密碼子ATG上游啟動子，首次在巴西橡膠樹中獲得橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3，該啟動子為橡膠樹內(nèi)源組成型啟動子，該啟動子在橡膠樹不同發(fā)育時(shí)期的多個(gè)組織中均具有高效轉(zhuǎn)錄活性，可用于驅(qū)動外源基因的表達(dá)，可應(yīng)用于橡膠樹轉(zhuǎn)基因體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系，從而實(shí)現(xiàn)對橡膠樹高效精準(zhǔn)的品種改良。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種橡膠樹內(nèi)源組成型啟動子，更具體涉及一種橡膠樹泛素基因的啟動子proHbUBI3，并進(jìn)一步公開其克隆方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

巴西橡膠樹(Hevea?Brasiliensis)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，是天然橡膠的唯一地商業(yè)化來源。橡膠樹作為一種多年生異花授粉樹種，幼齡期較長，多通過傳統(tǒng)的雜交育種進(jìn)行遺傳改良，但由于橡膠樹本身生長較為緩慢，導(dǎo)致了常規(guī)育種存在效率低、周期長的問題，這嚴(yán)重地阻礙了橡膠樹育種的進(jìn)程。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子育種技術(shù)在橡膠樹中的應(yīng)用加快了橡膠樹新品種的培育，并已發(fā)展出諸如農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等多種轉(zhuǎn)化方法將外源基因?qū)胂鹉z樹基因組用于橡膠樹的遺傳改良，從而提高橡膠樹的產(chǎn)量、增強(qiáng)抗病和耐環(huán)境脅迫能力、以及改善膠乳質(zhì)量等重要性狀。

在目前已知的所有植物轉(zhuǎn)基因體系中，啟動子是驅(qū)動選擇標(biāo)記和目標(biāo)基因表達(dá)的重要元件，它決定著下游基因的表達(dá)水平從而影響轉(zhuǎn)基因體系的篩選和再生效率以及最終轉(zhuǎn)基因株系的表現(xiàn)。目前已證實(shí)，從花椰菜花葉病毒中分離得到的一種組成型35S啟動子(CaMV?35S)是橡膠樹穩(wěn)定和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系中的應(yīng)用最廣泛的組成型啟動子，它具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，能夠在轉(zhuǎn)基因植株的整個(gè)生命周期內(nèi)在大多數(shù)組織中驅(qū)動下游基因的表達(dá)。近年來，隨著橡膠樹基因功能研究以及基因編輯體系的逐漸深入，很多情況下需要在轉(zhuǎn)基因株系中同時(shí)過表達(dá)多個(gè)外源基因以產(chǎn)生目標(biāo)性狀，也需要同時(shí)啟動報(bào)告基因、抗性基因等篩選標(biāo)記的表達(dá)以提高轉(zhuǎn)基因體系的篩選和再生效率。然而，大量研究表明，當(dāng)在轉(zhuǎn)基因作物中重復(fù)使用35S啟動子驅(qū)動表達(dá)多個(gè)外源基因時(shí)，啟動子區(qū)域的序列同源性會誘發(fā)35S啟動子甲基化，從而抑制下游基因的表達(dá)(Kanazawa等，2007，Plant?Molecular?Biology43,243-260.；Muskens等，2000，Plant?Cell?Reports?29,513-522.)。由此可見，缺少可用的內(nèi)源組成型啟動子已成為限制橡膠樹多基因轉(zhuǎn)化體系的重要因素。

泛素(Ubiquitin)是一類高度保守的小分子蛋白，廣泛存在于植物中。據(jù)報(bào)道，泛素基因的啟動子在植物中具有持久且高水平的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)具有甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。在水稻、大豆等多種作物的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，內(nèi)源組成型的泛素基因啟動子已得到廣泛地鑒定和應(yīng)用，并代替35S啟動子驅(qū)動外源基因的表達(dá)。目前在橡膠樹中，則尚未有內(nèi)源的組成型泛素基因啟動子應(yīng)用于橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道。因此，如何在橡膠樹基因組中篩選得到高度保守的橡膠樹泛素基因，對于橡膠樹的基因育種技術(shù)發(fā)展具有積極的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3，并進(jìn)一步公開其克隆方法及應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的一種橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3，所述啟動子proHbUBI3包括如SEQ?ID?No：1所示的DNA核苷酸序列。

優(yōu)選的，所述啟動子proHbUBI3的DNA核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示。

本發(fā)明還公開了一種表達(dá)載體，含有所述的橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3。

本發(fā)明還公開了一種瞬時(shí)表達(dá)載體，所述瞬時(shí)表達(dá)載體為重組質(zhì)粒proHbUBI3-163hGFP。