[發(fā)明專利]一種橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3及其克隆與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110431093.3
• 申請日: 2021-04-21
• 公開（公告）號: CN112980847B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 辛士超;戴雪梅;黃天帶;吉努烏達(dá)亞巴努;華玉偉;楊先鋒;黃華孫
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/84;C12N15/66;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/38
• 代理公司: 北京興智翔達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11768
• 代理人: 郭衛(wèi)芹

1.一種橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3，其特征在于，所述啟動子proHbUBI3的核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示。

2.一種表達(dá)載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3。

3.一種包含權(quán)利要求1所述的橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3的瞬時表達(dá)載體，其特征在于，所述瞬時表達(dá)載體為將權(quán)利要求1所述的橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3構(gòu)建到表達(dá)載體pJIT163-hGFP中獲得的重組質(zhì)粒proHbUBI3-163hGFP。

4.一種包含權(quán)利要求1所述的橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化表達(dá)載體，其特征在于，所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化表達(dá)載體為將權(quán)利要求3所述瞬時表達(dá)載體proHbUBI3-163hGFP上的proHbUBI3::hGFP表達(dá)框構(gòu)建到轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA3301上獲得的重組質(zhì)粒proHbUBI3-hGFP-pC3301。

5.一種克隆權(quán)利要求1所述橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）巴西橡膠樹熱研7-33-97葉片基因組DNA為模板，設(shè)計如下引物：

proHbUBI3-F：GCAAGTGCTAGCCACCGAAG；

proHbUBI3-R：CTGTTTAGAAGAAATAAACC；

（2）使用KOD?FX酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

（3）將擴(kuò)增產(chǎn)物TA克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dh5α中并挑單克隆測序，即得。

6.一種構(gòu)建權(quán)利要求3所述瞬時表達(dá)載體的方法，其特征在于，所述瞬時表達(dá)載體proHbUBI3-163hGFP的構(gòu)建方法包括將權(quán)利要求1所述的橡膠樹泛素基因啟動子proHbUBI3構(gòu)建到表達(dá)載體pJIT163-hGFP中，以替換掉該載體上的2×35S啟動子的步驟，具體包括如下步驟：

（1）設(shè)計如下引物分別在proHbUBI3序列5’和3’端引入SacI和NcoI酶切位點，引物設(shè)計如下：

proHbUBI3-sF：AGCGAGCTCGCAAGTGCTAGCCACCGAAG；

proHbUBI3-nR：ATGCCATGGCTGTTTAGAAGAAATAAACC；

（2）同時用SacI和NcoI雙酶切擴(kuò)增得到的啟動子片段和pJIT163-hGFP載體，分別回收1392bp?啟動子proHbUBI3和3671bp載體骨架片段；

（2）使用T4?DNA連接酶將proHbUBI3啟動子連接到pJIT163-hGFP載體的綠色熒光蛋白基因hGFP上游，即得所需重組質(zhì)粒proHbUBI3-163hGFP。