[發明專利]用于促進iPSC分化為胰島素分泌細胞的混合物及其制備方法

有效

• 申請號: 202110430287.1
• 申請日: 2021-04-21
• 公開（公告）號: CN113174363B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 李洋;張怡;蘆慧穎;李婷婷;劉艷青
• 申請（專利權）人: 天晴干細胞股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074;C12N5/0775
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 李紅媛

用于促進iPSC分化為胰島素分泌細胞的混合物及其制備方法，本發明是為了解決現有使用其他細胞誘導成功為胰島細胞的誘導成功率較低的問題。制備方法：一、培養誘導性多能干細胞融合至45％～55％時，完全培養基培養，得到iPSC上清液；二、向iPSC上清液中加入PEG8000貯存液，混勻后離心，沉降得到iPSC外泌體；三、間充質干細胞用完全培養基重懸細胞，加入iPSC外泌體，混勻培養得到MSC上清液；四、對MSC上清液和iPSC上清液分別進行超濾、離心處理；五、將MSC外泌體和iPSC外泌體混合。本發明通過驗證多次iPSC分化胰島素分泌細胞實驗后發現，細胞分化效率及胰島素釋放量，細胞標志物表達均有提高。

技術領域

本發明涉及一種促進iPSC分化為胰島素分泌細胞的混合物及其制備方法。

背景技術

糖尿病因其高患病率以及諸多并發癥嚴重威脅人類的健康和給醫保系統造成重大壓力。目前全世界患病人口約4.63億，由于人口老齡化和生活方式的改變，在未來幾十年受此疾病影響的人數將進一步增加,預計到2040年將超過6億。糖尿病包含1型和2型兩種，其中1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，造成大部分胰島β細胞喪失。患者需終身依賴外源性胰島素替代治療。而2型糖尿病占總發病率的80％以上，常見于中老年人，肥胖者發病率高。主要原因是機體細胞對于胰島素的敏感性下降。該類型的大多數患者最終也需胰島素治療。胰島β細胞屬內分泌細胞，約占胰島細胞總數的70％，能分泌胰島素，起促進細胞糖利用，調節血糖的作用。外源性注射胰島素并不能完全模擬生理性胰島素分泌模式，長期超大劑量(50u/d)胰島素使用會導致內皮細胞增生、粥樣硬化形成等不良反應，使用不當或病情嚴重時容易發生急性嚴重代謝紊亂。為了向臨床提供大量功能良好的移植物，定向誘導誘導性多能干細胞(iPSC)分化成胰島β樣細胞成為近年來的研究熱點，是成為治療糖尿病的一個較好方法。但目前，許多研究表明當前使用其他細胞誘導成功為胰島細胞的百分比只能達到40％左右，因此當前提高胰島細胞的誘導成功率至關重要。

外泌體直徑為40～100nm，內含核酸、脂質、蛋白質等多種活性物質。外泌體既可以作為載體傳遞mRNA、miRNA以及蛋白質等多種活性物質，通過受體-配體的結合來改變靶細胞信號傳導通道，又可以和靶細胞膜融合使靶細胞具有新的生物學特性，影響包括細胞因子的產生、細胞增殖、凋亡和新陳代謝等多種生命活動。己證實外泌體攜帶的miRNA在調節胰島p細胞功能方面起著至關重要的作用。iPSC來源的外泌體與骨髓間充質干細胞(BMSC)共同培養，與單一BMSC相比，其成骨能力和增殖能力顯著增強。

發明內容

本發明是為了解決現有使用其他細胞誘導成功為胰島細胞的誘導成功率較低的問題，而提供一種用于促進iPSC分化為胰島素分泌細胞的混合物及其制備方法。

本發明用于促進iPSC分化為胰島素分泌細胞的混合物的制備方法按照以下步驟實現：

一、培養第20-30代誘導性多能干細胞(iPSC)融合至45％～55％時，更換完全培養基繼續培養，收集培養上清液，得到iPSC上清液；

二、將PEG8000溶于無菌PBS中配制成溶液，消毒后得到PEG8000貯存液，向iPSC上清液中加入PEG8000貯存液，充分混勻后靜置、離心，吸除上清液，沉降得到iPSC外泌體；

三、復蘇第3-4代臍帶間充質干細胞(MSC)，用完全培養基重懸細胞，然后加入iPSC外泌體，混勻后轉移至培養瓶中，培養得到MSC上清液；

四、對步驟三得到的MSC上清液和iPSC上清液分別進行超濾、離心處理，分別得到MSC外泌體和iPSC外泌體；

五、將MSC外泌體和iPSC外泌體混合，得到用于促進iPSC分化為胰島素分泌細胞的混合物。

本發明用于促進iPSC分化為胰島素分泌細胞的混合物是由體積比為(1～2)：(1～2)的iPSC外泌體和MSC外泌體的混合物。