[發明專利]一種熒光蠶絲材料的制備方法

在審

• 申請號: 202110426153.2
• 申請日: 2021-04-20
• 公開（公告）號: CN113136202A
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 王峰;夏慶友;趙萍;田弛
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07K14/435;C07K1/34;B01J13/00;C08L89/00;C08J5/18
• 代理公司: 重慶智慧之源知識產權代理事務所(普通合伙) 50234
• 代理人: 余洪;高彬

本發明提供一種熒光蠶絲材料的制備方法，從轉基因家蠶品種的蠶繭中提取DsRed1蛋白、超濾濃縮后得到DsRed1濃縮液；對所述DsRed1濃縮液進行堿性蛋白酶滅活得到熒光蛋白溶液；對所述熒光蛋白溶液與絲素蛋白溶液混合后冷凍干燥得到DsRed1/Fibroin凍干復合物；簡化了熒光蠶絲材料的制備過程，提高外源蛋白，尤其是紅色熒光蛋白的表達效率與生物活性，降低生產成本。

技術領域

本發明應用于生物技術領域，具體涉及一種熒光蠶絲材料的制備方法。

背景技術

隨著21世紀生物工程以及基因工程的迅速發展，人們對醫用、藥用、食用、美容、保健等各種用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然來源的蛋白質提取和生產已無法滿足快速增長的市場需求。建立和完善各種高效的原核和真核表達系統，并利用菌株、細胞和昆蟲等作為宿主生物反應器，是實現低成本、規模化生產具有生物學活性的重組外源蛋白的有效和可持續方法，并成為當今世界研究的熱點。利用中國倉鼠卵巢細胞作為生物反應器生產外源蛋白是目前最為標準的表達模式，但其運營成本和對環境的要求極為苛刻，嚴重限制了其大規模推廣應用。為了建立低成本、規模化、安全可持續的高效生產外源蛋白的生物工廠，自2000年以來，科研人員開始嘗試利用轉基因生物，如哺乳動物、鳥類、昆蟲以及植物的器官作為生物反應器來生產重組外源蛋白。

家蠶以泌絲著稱，是最早被人類所完全馴化利用的經濟動物(昆蟲)之一。絹絲腺是合成、分泌蠶絲蛋白的唯一器官，為整個蠶絲業的生物學基礎。經過數千年的人工馴化，家蠶的絹絲腺具備了超強的蛋白質合成與分泌能力，一頭體重5g左右家蠶能合成分泌約0.5g蠶絲蛋白，為目前已知昆蟲之最。蠶絲蛋白主要由絲素蛋白(fibroin)和覆被在其外層的絲膠蛋白(sericin)構成：絲素蛋白是蠶絲的主體，約占75％，由蠶的后部絲腺合成，包括fib-H鏈、fib-L鏈和P25三種主要組分，均不溶于水；其余為絲膠蛋白，約占25％，由蠶的中部絲腺合成，包括絲膠1(Sericin1)、絲膠2(Sericin2)和絲膠3(Sericin3)三種主要組分，其中又以絲膠1蛋白含量最高，均可溶于水。隨著現代分子生物學和轉基因技術的發展，家蠶絹絲腺的高效合成與分泌絲蛋白這一特征，以及所具備的糖基化、甲基化等對外源蛋白保持活性極其重要的蛋白質翻譯后修飾加工能力，飼養成本低，可工廠化生產，對人畜安全等特點，使其成為理想的生物反應器模型，備受各國研究人員關注并競相開發利用。

從1962年下村修等在名為Aequorea victoria的水母體內發現并分離得到最早的熒光蛋白綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)開始，人們對于熒光蛋白的進一步研究和應用都沒有停止過。近年來，國內外利用piggyBac轉座子介導的轉基因技術以及家蠶組織特異啟動子元件在絲腺中嘗試表達了多個外源蛋白，包括：在后部絲腺表達了絲素重鏈融合的EGFP(Zhao et al.2010)、貓干擾素(Kurihara et al.2007)、增強型綠色熒光蛋白(Kojima et al.2007)、蜘蛛絲牽引蛋白(Zhu et al.2010)，絲素輕鏈融合的人Ⅲ型膠原蛋白的部分肽段(Tomita et al.2003)、增強型綠色熒光蛋白(Tomita etal.2003)、羥基脯氨酸膠原部分肽段(Adachi et al.2006)、成纖維細胞生長因子(Hino etal.2006)、部分膠原蛋白肽段(Yanagisawa et al.2007)，以及P25融合的紅色熒光蛋白(Royer et al.2005)等。但上述研究成果的產業化推進頗為困難，主要原因在于：這類絲素重鏈表達系統由于調控元件較為單一，并且外源蛋白需要與內源絲蛋白進行融合才能實現分泌表達，對外源蛋白的表達量和生物活性產生不利影響，研究人員嘗試過蛋白復性策略，但是流程繁瑣且收效甚微，因而極大的限制的絲素重鏈表達系統的應用。

熒光蠶絲作為一種新型的生物功能材料，在組織工程、生物成像、智能服裝、生物電子等領域展現出巨大的應用前景，但目前熒光蠶絲多采用后處理改性的方式對蠶絲進行染色，不但不環保，而且蠶絲的光穩定性和生物相容性差；現有的基因改性方法也多采用外源蛋白與內源絲蛋白融合的方式，制備過程繁瑣，成本高，難以大規模推廣應用。

發明內容