[發(fā)明專利]一種新型高溫Argonaute蛋白的表征及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110425455.8
• 申請日: 2021-04-20
• 公開（公告）號: CN113106087B
• 公開（公告）日: 2023-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮雁;孫瑩瓔;郭翔;陸慧;李忠磊
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12N15/70;C12N15/55;C12N9/22
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 張璐;徐迅

本發(fā)明提供了一種新型高溫Argonaute蛋白的表征及應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種核酸切割體系，其特征在于，所述核酸切割體系包括：(a)向?qū)NA(gDNA)；(b)可編程核酸內(nèi)切酶Argonaute(Ago)；和(c)任選的報(bào)告核酸，其中若所述報(bào)告核酸被剪切，所述的剪切是可以被檢測出的。并且，本發(fā)明還提供了基于本發(fā)明的可編程核酸內(nèi)切酶Ago的一種富集和檢測低豐度目標(biāo)核酸的體系和方法。本發(fā)明所提供的檢測體系和方法能夠特異性地針對低豐度的核酸進(jìn)行有效富集和高效檢測，并且本發(fā)明的可編程核酸內(nèi)切酶Ago具有強(qiáng)大的基因操作潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型高溫Argonaute蛋白的表征及應(yīng)用。

背景技術(shù)

Argonaute(Ago)蛋白最早在一項(xiàng)描述擬南芥的突變體的研究中被提及。Ago蛋白是真核RNA干擾(RNAi)途徑的關(guān)鍵參與者，可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而防御宿主入侵的RNA病毒并保護(hù)基因組完整性。目前已報(bào)道的Ago蛋白主要分為真核Ago(eAgo)和原核Ago(pAgo)兩類。

原核Ago可以結(jié)合單鏈的guide DNA或RNA，催化與guide互補(bǔ)配對的靶標(biāo)DNA或RNA的剪切。與CRISPR/Cas系統(tǒng)不同，原核Ago在對靶標(biāo)核酸鏈進(jìn)行剪切時(shí)，不需要PAM序列，它可以結(jié)合與靶標(biāo)核酸互補(bǔ)的guide(DNA或RNA)，在靶標(biāo)的任意位置進(jìn)行剪切。

來源于古菌的高溫Ago蛋白可在70℃以上發(fā)揮剪切活性，目前已表征的高溫Ago一般可以在高溫條件下，結(jié)合單鏈guide DNA或RNA，剪切靶標(biāo)單鏈DNA,少數(shù)也可以剪切靶標(biāo)單鏈RNA。

Ago蛋白近些年來也被應(yīng)用于基因檢測領(lǐng)域，由于其具有對野生型基因和突變型基因選擇性剪切的性質(zhì)，因此可以用于腫瘤相關(guān)基因中低豐度突變DNA的富集，如已經(jīng)報(bào)道過的TtAgo和PfAgo。其中，利用新型核酸切割工具酶PfAgo，并偶聯(lián)PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)邊切割-邊擴(kuò)增的過程，而建立的“A-STAR(Ago-mediated Specific Target detection)”技術(shù)，便是一種具有高特異性并且可以結(jié)合多終端檢測技術(shù)的富集技術(shù)。由于目前臨床上針對稀有突變檢測方法的局限性，新型檢測技術(shù)及新型核酸工具酶的研究越來越成為研究熱點(diǎn)。

然而，目前一些利用核酸工具酶的檢測方法中，仍具有檢測成本較高、步驟繁瑣的不足。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種更加高效的低豐度DNA富集和檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是提供一種更加高效的低豐度DNA富集和檢測方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸切割體系，所述核酸切割體系包括：

(a)向?qū)NA(gDNA)；

(b)可編程核酸內(nèi)切酶Argonaute(Ago)；和

(c)任選的報(bào)告核酸，其中若所述報(bào)告核酸被剪切，所述的剪切是可以被檢測出的。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸切割體系的溫度為80-99.9℃，較佳地為90-99.9℃，更佳地為94-96℃，更佳地為95℃。