[發明專利]一種酶法改性聯合反相柱色譜分離制備高純度二亞油酰磷脂酰膽堿的方法和其產物

有效

• 申請號: 202110423929.5
• 申請日: 2021-04-20
• 公開（公告）號: CN113174412B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發明（設計）人: 從艷霞;張維農;齊玉堂;劉思敏;張海龍
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12P7/6458
• 分類號: C12P7/6458;C12P7/6481;C12P7/6472;C12P13/00;C07F9/10
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 趙爽

本發明屬于磷脂加工領域，具體涉及一種酶法改性聯合反相柱色譜分離制備高純度二亞油酰磷脂酰膽堿的方法和其產物。本發明以高純磷脂酰膽堿(PC)和亞油酸為原料，在脂肪酶反應之前采用超聲波連續流細胞破碎儀對底物和脂肪酶進行預混，上述體系反應產物經過丙酮脫溶得到富含二亞油酰磷脂酰膽堿的丙酮不溶物，上述丙酮不溶物在C18為固定相的色譜上，經過低碳醇或低碳醇?水溶液洗脫，獲得純度大于95％、得率高于65％的DLPC產物。本發明制備方法條件溫和、高效、操作簡單可控，易于實現工業化生產，采用上述方法獲得的二亞油酰磷脂酰膽堿純度高，得率高，可為醫藥保健行業高純度二亞油酰磷脂酰膽堿的重要來源。

技術領域

本發明屬于磷脂加工領域，更具體地，涉及一種酶法改性聯合反相柱色譜分離制備高純度二亞油酰磷脂酰膽堿的方法和其產物。

背景技術

二亞油酰磷脂酰膽堿(DLPC)屬于多烯磷脂，是大豆卵磷脂(PC)的主要活性成分。DLPC是人體細胞膜的基本構成組分，對于維持生物膜的細胞活性和基體的正常新陳代謝具有重要意義。DLPC具有治療肝硬化、預防纖維化、保護和治療肝損傷等功效，還有助于促使血液和肝臟總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平下降、高密度脂蛋白增加，以改善其脂質代謝。

Lipozyme TL IM作為一種脂肪酶廣泛應用于油脂酶法酯交換，也有文獻報道Lipozyme TL IM同樣對磷脂具有催化作用。Marsaoui et al.等以大豆卵磷脂：DHA/EPA乙酯(m/m，1:6)為原料，Lipozyme TL IM在水分含量為1.25％的無溶劑體系下對磷脂進行酶法改性，EPA/DHA磷脂得率為12.3％。Hossen and Hernandez et al.研究結果顯示大豆磷脂：亞麻酸(m/m，1:5)Lipozyme TL IM的催化作用下，57℃條件下反應48h，得到亞麻酸磷脂得率為16％。Vikbjerg et al以卵磷脂：辛酸(m/m，1:6)為原料，在填充Lipozyme TL IM的反應柱中連續反應24-48h，辛酸磷脂得率27.3-37.4％。曹棟等以固定化脂肪酶LipozymeTL IM為工具酶，于正庚烷體系中催化大豆卵磷脂與亞油酸的酸解反應，氣相檢測結果顯示改性磷脂中亞油酸含量最高達83.24％，但實際上磷脂中亞油酸含量僅提高了18.67％，且該產物中除了含有二亞油酰磷脂酰膽堿還同時含有sn-1亞油酰磷脂酰膽堿、sn-2亞油酰磷脂酰膽堿、亞油酰乙醇胺等。綜上，Lipozyme TL IM能催化磷脂酰膽堿與脂肪酸的酸解反應，但其催化效率較低，時間較長。

現有文獻研究了卵磷脂質量濃度、底物摩爾比、酶添加量、水分添加量、反應時間、反應溫度對酯交換反應的影響，結果仍不盡人意。因此，發明一種高效、綠色環保的分離純化制備二亞油酰磷脂酰膽堿的方法具有很好的經濟效益與社會價值。

發明內容

本發明的目的在于解決上述問題，公開一種酶法改性聯合柱色譜分離制備高純度二亞油酰磷脂酰膽堿的方法，該方法工藝簡單、高效、綠色環保、成本低，能夠制備純度大于95％的二亞油酰磷脂酰膽堿，且其得率大于65％。解決了現有技術生產工藝復雜、反應時間長、產物純度低、成本高等問題。

本發明將大豆濃縮磷脂經過丙酮脫脂、低碳醇溶液萃取和低溫重結晶獲得高純度磷脂酰膽堿原料(≥90％)，其中二亞油酰磷脂酰膽堿含量為28～36％；以上述高純度磷脂酰膽堿為原料，在超聲波連續流細胞破碎儀下將其與亞油酸、脂肪酶等進行預混，混合體系在在脂肪酶的作用下進行催化反應，得到酶法改性磷脂混合物；酶法改性磷脂混合物經過丙酮洗滌除去脂肪酸，得到富含DLPC的丙酮不溶物；上述丙酮不溶物在以C18為固定相材料的制備柱色譜上經過低碳醇水溶液洗脫，通過制備系統的自帶紫外在線檢測器(UV)在203nm波長下對洗脫液進行檢測，收集高純度DLPC洗脫液，低溫脫溶、干燥得到DLPC。采用紫外-高效液相色譜進行檢測DLPC和PC含量。

本發明的第一方面提供一種酶法改性聯合反相柱色譜分離制備高純度二亞油酰磷脂酰膽堿的方法，該方法包括：