[發明專利]一種假性慢病毒載體高效感染人臍帶間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 202110423501.0
• 申請日: 2021-04-20
• 公開（公告）號: CN113430231A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 李海森
• 申請（專利權）人: 華夏源細胞工程集團股份有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 武漢尚齊知識產權代理事務所(普通合伙) 42261
• 代理人: 王攀

本發明涉及人間充質干細胞和基因治療技術領域，具體是一種假性慢病毒載體高效感染人間充質干細胞的方法，本發明使用人臍帶間充質干細胞與攜帶熒光報告蛋白的假性慢病毒顆粒，先制成小體積的細胞和病毒混合液，進行單細胞狀態下的短時間小體積懸浮感染；然后于最低限度培養液體積中繼續培養至感染完成。本發明極大地提高了假性慢病毒成功感染人臍帶間充質干細胞的效率，為假性病毒載體高效感染對促感染試劑敏感的靶細胞提供了一種方案。此外，本發明將假性慢病毒載體感染人臍帶間充質干細胞的時長較之現有技術縮短50％以上，節省了時間成本，方便操作。

技術領域

本發明涉及人間充質干細胞和基因治療技術領域，具體是一種假性慢病毒載體高效感染人臍帶間充質干細胞的方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells)是一種分布廣泛的多能性干細胞，具有自我更新和分化能力，在合適的條件下能分化為脂肪細胞、內皮細胞、肝細胞、肌細胞、骨細胞、胰腺細胞等多種終末細胞類型。分離間充質干細胞的組織來源很廣泛，迄今為止已從骨髓、脂肪、肌肉、牙髓、滑膜、臍帶、胎盤、羊膜、真皮、臍血等組織器官中分離獲得了間充質干細胞。盡管不同來源的間充質干細胞在分子特征和疾病治療潛力上有所差異，但各種來源的間充質干細胞都表達 CD73、CD90和CD105三種表面標記物，并且在標準培養條件下呈貼壁生長狀態。間充質干細胞不僅具有易獲取、大規模培養擴增、可凍存、無倫理學問題等特點，而且其細胞表面低表達主要組織相容性復合物和共刺激因子，從而使異體間充質干細胞移植治療疾病時安全性很高。鑒于間充質干細胞上述優點，間充質干細胞不僅在臨床前動物模型中能改善糖尿病、心肌梗死、神經退行性病變、腎病、骨關節炎、皮膚病等多種疾病，而且在部分臨床人體實驗中其安全性和有效性都得到了驗證。人間充質干細胞用于治療血管閉塞性動脈炎、急性心肌梗死、克羅恩病并發肛瘺和軟骨損傷的“細胞藥”產品已經獲批上市。間充質干細胞通過分化、免疫調節、抗凋亡、抗氧化等多種途徑發揮其疾病治療效果，而且在不同疾病環境中其主要效應方式是不一樣的。間充質干細胞通過細胞間直接接觸或旁分泌方式改善疾病狀態，并且越來越多的研究表明間充質干細胞治療疾病主要經其旁分泌因子傳遞介導。

由于間充質干細胞移植不會轉移自身遺傳物質給受體器官組織，間充質干細胞可以作為基因編輯技術的細胞載體將基因編輯療法高效地應用在難以治愈的疾病上。相比質粒瞬時轉染引起的短暫基因表達變化，攜帶特定基因編輯序列的假性病毒載體感染人源干細胞由于長時間改變靶基因表達進而能維持基因和細胞治療的長有效期，近年來漸漸成為介導基因修飾最常用的手段之一。然而，假性病毒載體編輯人源干細胞的現有技術方法存在感染率不高和耗時長等諸多問題，限制了基因編輯聯合人源干細胞治療疾病的廣泛使用。

發明內容

針對上述問題，本發明提出了一種假性慢病毒載體高效感染人臍帶間充質干細胞的方法，極大地提高了假性病毒載體感染人間充質干細胞的效率，擴展了基因編輯聯合人間充質干細胞治療疾病的應用潛能和可行性。

本發明提出的技術方案如下：一種假性慢病毒載體高效感染人臍帶間充質干細胞的方法，所述方法包括以下步驟：

S1：傳代培養人臍帶間充質干細胞，制備成單細胞狀態的人臍帶間充質干細胞懸液；

S2：將所述人臍帶間充質干細胞與攜帶綠色熒光報告蛋白的假性慢病毒顆粒按數目比值先后加入EP管，制成小體積的細胞病毒混合液；

S3：培養箱懸浮培養1小時所述細胞病毒混合液，孵育期間定期吹打混勻所述細胞病毒混合液，進行短時間小體積懸浮感染；

S4：轉移所述細胞病毒混合液至細胞培養皿，加入適量的人臍帶間充質干細胞培養基，使所述細胞病毒混合液達到最低限度培養液體積，即培養皿所需正常培養液量的60％，繼續培養至感染完成。

S5：在使用該方法進行感染時，可在人臍帶間充質干細胞接觸假性病毒顆粒期間添加促感染試劑。

由于是通過小體積懸浮培養的方式完成本發明，故將本發明提出的方法簡稱為小體積策略。