[發(fā)明專利]一種假性慢病毒載體高效感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110423501.0
• 申請(qǐng)日: 2021-04-20
• 公開（公告）號(hào): CN113430231A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李海森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華夏源細(xì)胞工程集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 武漢尚齊知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42261
• 代理人: 王攀

1.一種假性慢病毒載體高效感染人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

S1：傳代培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞，制備成單細(xì)胞狀態(tài)的人間充質(zhì)干細(xì)胞懸液；

S2：將所述人間充質(zhì)干細(xì)胞與攜帶綠色熒光報(bào)告蛋白的假性慢病毒顆粒按數(shù)目比值先后加入EP管，制成小體積的細(xì)胞病毒混合液；

S3：培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)1小時(shí)所述細(xì)胞病毒混合液，孵育期間定期吹打混勻所述細(xì)胞病毒混合液，進(jìn)行短時(shí)間小體積懸浮感染；

S4：轉(zhuǎn)移所述細(xì)胞病毒混合液至細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入適量的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，使所述細(xì)胞病毒混合液達(dá)到最低限度培養(yǎng)液體積，即培養(yǎng)皿所需正常培養(yǎng)液量的60％，繼續(xù)培養(yǎng)至感染完成。

S5：在使用該方法進(jìn)行感染時(shí)，可在人間充質(zhì)干細(xì)胞接觸假性病毒顆粒期間添加促感染試劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假性慢病毒載體高效感染人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：在S1中，所述傳代培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞指復(fù)蘇低代數(shù)凍存的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；所述制備單細(xì)胞狀態(tài)的人間充質(zhì)干細(xì)胞懸液指用工作濃度為0.25％的胰蛋白酶消化所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假性慢病毒載體高效感染人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：在S2中，所述人間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；所述綠色熒光報(bào)告蛋白為ZsGreen綠色熒光蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假性慢病毒載體高效感染人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：在S2中，所述人間充質(zhì)干細(xì)胞和假性慢病毒顆粒的數(shù)目比值指間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù):慢病毒顆粒數(shù)為1：20或1：80。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假性慢病毒載體高效感染人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：在S2中，所述EP管為0.5ml錐形微量EP管；所述細(xì)胞病毒混合液的小體積量為60μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假性慢病毒載體高效感染人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：在S3中，所述培養(yǎng)箱為37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱；所述定期吹打混勻細(xì)胞病毒混合液指每隔12分鐘用200μL槍頭輕輕吹打3次。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假性慢病毒載體高效感染人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：在S4中，所述培養(yǎng)皿所需正常培養(yǎng)液量為24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的單個(gè)培養(yǎng)孔所需的500μL。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假性慢病毒載體高效感染人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：在S4中，所述細(xì)胞病毒混合液繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間為9小時(shí)或21小時(shí)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假性慢病毒載體高效感染人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：在S5中，所述促感染試劑為終濃度4μg/ml的Polybrene。