[發明專利]一種總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法及其檢測試劑盒和應用

在審

• 申請號: 202110418069.6
• 申請日: 2021-04-19
• 公開（公告）號: CN113189252A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 禹松林;邱玲;程歆琦;馬曉麗;鄒雨桐
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

本發明涉及分析檢測技術領域，具體涉及一種總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法及其檢測試劑盒和應用。本發明的總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法包括總鈷胺素的檢測和氰鈷胺的檢測，所述總鈷胺素的檢測包括：將待測樣品進行衍生處理，再采用液相色譜串聯質譜法進行檢測，所述衍生處理采用的衍生劑包括第一衍生劑和第二衍生劑，所述第一衍生劑為含有1?5g/L氰化鈉或氰化鉀以及10?100g/L氫氧化鈉的水溶液；所述第二衍生劑為1?10g/L的二硫代蘇糖醇水溶液，pH為2?9。該方法用樣量少，檢測速度快，且具有較高的準確度和精密度，可顯著提高總鈷胺素和氰鈷胺檢測的準確性和有效性，為各種鈷胺素的含量測定提供了有效的技術手段。

技術領域

本發明涉及分析檢測技術領域，具體涉及一種總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法及其檢測試劑盒和應用。

背景技術

維生素B12(vitamin B12)又稱鈷胺素(cobalamin)、氰鈷胺素，其分子結構(圖1)是以鈷離子為中心的咕啉環和5,6-二甲基苯并咪唑為堿基組成的多環化合物。因中央鈷分子上結合的基團(圖1中的“R”：5-脫氧腺苷、甲基、羥基、氰根離子)不同，維生素B12有多種活性形式，包括腺苷鈷胺、甲鈷胺、羥鈷胺、氰鈷胺。在人體內，腺苷鈷胺和甲鈷胺可作為人體中酶的輔因子，腺苷鈷胺是甲基丙二酰輔酶A的輔酶，參與甲基丙二酸輔酶A向琥珀酰輔酶A的轉化。甲鈷胺是甲硫氨酸合成酶的輔酶，參與甲硫氨酸與同型半胱氨酸的代謝。在體外血中腺苷鈷胺和甲鈷胺含量很低，主要存在于細胞內，羥鈷胺和氰鈷胺則可存在于離心后血清或血漿中。

目前已有的檢測樣品中維生素B12的方法大部分基于免疫學方法(同位素放射免疫法，電化學發光免疫法，化學發光免疫法，熒光免疫分析法等)等。在臨床最為常用的方法是采用化學發光原理的免疫學方法，其檢測方便、快速、通量較高，然而，基于抗原抗體反應原理的免疫學方法可能存在著潛在的交叉干擾，譬如內因子抗體陽性時，可能干擾維生素B12的測定，使得維生素B12假性升高。

LC-MS/MS方法作為小分子代謝物的參考方法可為維生素B12的準確測定提供潛在的有力工具，然而目前LC-MS/MS方法對維生素B12營養的評估多為測定其代謝物-甲基丙二酸來間接反映維生素B12營養水平。另外，已報道的LC-MS/MS測定維生素B12多為測定鈷胺素中的一種，如氰鈷胺(D'Ulivo L，et al.Determination of cyanocobalamin byisotope dilution LC-MS/MS.Anal Chim Acta.2017Oct 16；990:103-109.)，無法真實反映維生素B12的總含量。

發明內容

本發明的目的是提供一種總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法，該方法可檢測樣品中的總鈷胺素含量，還可檢測樣品中的氰鈷胺含量，并根據兩者確定其他維生素B12的活性形式的含量。本發明還提供基于該檢測方法的檢測試劑盒及其應用。

本發明的檢測方法為基于液相色譜串聯質譜檢測技術建立，通過衍生化前處理方法，定量血液等樣本中不同形式鈷胺素(維生素B12)的總含量(總鈷胺素)以及氰鈷胺的含量。其中，總鈷胺素的測定方法為基于以下構思建立：根據不同鈷胺素的結構差異，采用衍生化方法，使不同形式的鈷胺素均衍生為其最穩定的氰鈷胺形式，而后進行樣本提取，再在液相色譜質譜儀器上結合氰鈷胺的分子量，其在質譜中產生特異的質量/電荷比(質荷比)以及在色譜中的極性，采用同位素內標法實現對總鈷胺素的定量。氰鈷胺的測定方法為基于以下構思建立：氰鈷胺在體外較為穩定，因此不經過衍生，在液相色譜質譜儀器上結合氰鈷胺的分子量，其在質譜中產生特異的質量/電荷比(質荷比)以及在色譜中的極性，采用同位素內標法實現對氰鈷胺的定量。

具體地，本發明提供以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法，該方法包括總鈷胺素的檢測和氰鈷胺的檢測，所述總鈷胺素的檢測包括：將待測樣品進行衍生處理，再采用液相色譜串聯質譜法進行檢測，

所述衍生處理采用的衍生劑包括第一衍生劑和第二衍生劑，