[發明專利]一種總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法及其檢測試劑盒和應用

在審

• 申請號: 202110418069.6
• 申請日: 2021-04-19
• 公開（公告）號: CN113189252A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 禹松林;邱玲;程歆琦;馬曉麗;鄒雨桐
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

1.一種總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法，其特征在于，包括總鈷胺素的檢測和氰鈷胺的檢測，所述總鈷胺素的檢測包括：將待測樣品進行衍生處理，再采用液相色譜串聯質譜法進行檢測，

所述衍生處理采用的衍生劑包括第一衍生劑和第二衍生劑，

所述第一衍生劑為含有1-5g/L氰化鈉或氰化鉀以及10-100g/L氫氧化鈉的水溶液；所述第二衍生劑為1-10g/L的二硫代蘇糖醇水溶液，pH為2-9。

2.根據權利要求1所述的總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法，其特征在于，所述衍生劑還包括第三衍生劑，所述第三衍生劑為含有0.1％-10％甲酸的水溶液。

3.根據權利要求1或2所述的總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法，其特征在于，所述衍生處理包括：將所述待處理樣品與樣品制備液混合后分離上清液，將所述上清液干燥后，與所述第一衍生劑和所述第二衍生劑混合，反應5-15分鐘后，再將反應體系與所述第三衍生劑混合，得到衍生化的樣品；

優選地，所述樣品制備液為含有同位素標記氰鈷胺的甲醇溶液；

更優選地，將所述衍生化的樣品經萃取、干燥、復溶后再進行液相色譜分離。

4.根據權利要求1或2所述的總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法，其特征在于，所述氰鈷胺的檢測包括：將所述待處理樣品與所述樣品制備液混合后分離上清液，將所述上清液干燥后，與所述第三衍生劑混合，經萃取、干燥、復溶后，再采用液相色譜串聯質譜法進行檢測。

5.根據權利要求1～4任一項所述的總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法，其特征在于，所述檢測中，液相色譜的流動相包括流動相A和流動相B，所述流動相A為含有0.01-0.5％甲酸的水溶液，所述流動相B為甲醇。

6.根據權利要求5所述的總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法，其特征在于，所述流動相按照以下梯度進行梯度洗脫：0-0.5min，流動相A 95％，0.5-3.0min，流動相A 95-50％，3.0-4.0min，流動相A 50％，4.0-4.01min，流動相A 50-2％，4.01-4.5min，流動相A 2％，4.5-5.0min，流動相A 2-95％；

優選地，所述流動相的流速為0.3-0.5mL/min。

7.根據權利要求1～6任一項所述的總鈷胺素和氰鈷胺的檢測方法，其特征在于，質譜檢測條件如下：多離子監測反應模式，正離子模式，電噴霧電離，離子源溫度400～600℃，同時監測氰鈷胺和氰鈷胺內標的離子對：氰鈷胺-定量：m/z 678.3→147.1；氰鈷胺-定性：m/z678.3→997.6；氰鈷胺同位素內標：m/z 681.7→154.02。

8.用于總鈷胺素的液相色譜串聯質譜檢測的衍生劑，其特征在于，所述衍生劑包括第一衍生劑和第二衍生劑，

所述第一衍生劑為含有1-5g/L氰化鈉或氰化鉀以及10-100g/L氫氧化鈉的水溶液；

所述第二衍生劑為1-10g/L的二硫代蘇糖醇水溶液，pH為2-9；

優選地，所述衍生劑還包括第三衍生劑，所述第三衍生劑為含有0.1％-10％甲酸的水溶液。

9.一種總鈷胺素和氰鈷胺的檢測試劑盒，其特征在于，包括：

試劑I：含有1-5g/L氰化鈉或氰化鉀以及10-100g/L氫氧化鈉的水溶液，用于樣品衍生化處理；

試劑II：1-10g/L的二硫代蘇糖醇水溶液，用于樣品衍生化處理；

試劑III：含有0.1％-10％甲酸的水溶液，用于樣品衍生化處理；

試劑IV：含有0.01-0.5％甲酸的水溶液，用于作為液相色譜分離的流動相A；

試劑V：甲醇，用于作為液相色譜分離的流動相B；

優選地，所述試劑盒還包括：

試劑VI：氰鈷胺的同位素內標，濃度為50-1000nmol/L；

試劑VII：氰鈷胺標準品。

10.權利要求8所述的衍生劑或權利要求9所述的試劑盒在總鈷胺素和氰鈷胺檢測中的應用。