[發(fā)明專利]一種高效合成乳鐵蛋白的畢赤酵母及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110415407.0
• 申請日: 2021-04-18
• 公開（公告）號: CN112940955B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉龍;陳堅;呂雪芹;堵國成;李江華;劉延峰;崔世修
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/67;C12N15/31;C12N15/12;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明涉及一種高效合成乳鐵蛋白的畢赤酵母及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，本發(fā)明在細(xì)胞內(nèi)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分別表達(dá)不同的分子伴侶，進(jìn)一步優(yōu)化分子伴侶之間的組合，通過發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)，不同分子伴侶之間的組合能夠?qū)е虏煌牡鞍追置谒健Ｆ渲挟?dāng)分子伴侶分別為HSP70和Sec61a時，乳鐵蛋白的分泌得到明顯的改善，通過western blot發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白的表達(dá)量增加了約3.8倍，達(dá)到了570mg/L。本發(fā)明通過不同分子伴侶之間的組合，能夠有效的提高乳鐵蛋白的表達(dá)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于代謝工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種高效合成乳鐵蛋白的畢赤酵母及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)是一種能夠結(jié)合鐵的糖蛋白，并且是較大的轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一部分。乳鐵蛋白廣泛存在于粘膜分泌物(眼淚，唾液，陰道液，尿液，鼻和支氣管分泌物，膽汁，胃腸液)中，尤其在牛初乳和人初乳中含量最高，分別達(dá)到1g/L和5g/L。乳鐵蛋白是一種包含大約703個氨基酸的單鏈蛋白，分子量約為80kDa，折疊成兩個球形小葉，其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和β-折疊交替排列而成，且α-螺旋明顯多于β-折疊；乳鐵蛋白的高級結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，由多肽鏈折疊成。

LF在體內(nèi)不僅發(fā)揮轉(zhuǎn)運鐵離子的作用，同時還具有廣泛的生物學(xué)活性，包括廣譜抗菌作用、消炎、抑制腫瘤細(xì)胞生長及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等，從而具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，清除有害的自由基并抑制幾種有毒化合物形成的功能。因此，LF被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌的藥物。目前，LF已被添加到許多商業(yè)產(chǎn)品中，包括嬰兒配方粉、熱療飲料、發(fā)酵乳、化妝品和牙膏等。LF的多種促進(jìn)健康的功能及其在現(xiàn)實生活中的廣泛應(yīng)用激發(fā)了越來越多的研究興趣。

目前，獲得乳鐵蛋白的方式主要是從牛乳中分離提取，然而，牛乳僅含有0.03-0.49g/L乳鐵蛋白。在提取的過程中不僅價格昂貴，而且人體食用異源蛋白可能會帶來一定的負(fù)面影響，產(chǎn)生抗原反應(yīng)。為了獲得大量乳鐵蛋白，同時避免其帶來的副作用，研究者基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)人LF。其中，生產(chǎn)乳鐵蛋白的宿主細(xì)胞主要包括大腸桿菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞以及植物細(xì)胞。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺乏糖基化修飾機(jī)制，導(dǎo)致不能生產(chǎn)具有生物活性的乳鐵蛋白。哺乳動物細(xì)胞和植物細(xì)胞雖然能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶腔揎棧怯捎诩?xì)胞生長周期長、培養(yǎng)復(fù)雜，難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

在過去的十幾年中，研究者以酵母細(xì)胞作為宿主進(jìn)行了人LF的異源表達(dá)。酵母表達(dá)系統(tǒng)雖然具有生長快，操作簡單的特點，還具各翻譯后加工和修飾功能，但其系統(tǒng)固有的一些缺陷比如人源性蛋白分子、細(xì)胞因子不能在酵母中高效表達(dá)，并且蛋白產(chǎn)物容易形成多聚體進(jìn)而導(dǎo)致蛋白降解。

研究者主要通過優(yōu)化酵母表達(dá)系統(tǒng)中的關(guān)鍵表達(dá)元件(啟動子、終止子、增強(qiáng)子以及沉默子)，增強(qiáng)外源蛋白的表達(dá)水平。但是當(dāng)外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)大量積累時，對細(xì)胞分泌系統(tǒng)造成很大的壓力，易引起細(xì)胞的崩潰，導(dǎo)致外源蛋白的降解，減少蛋白的產(chǎn)量。為了增強(qiáng)外源基因的表達(dá)水平，首要解決外源蛋白能夠進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并進(jìn)行正確的折疊和修飾，從而實現(xiàn)外源蛋白的順利分泌。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，促進(jìn)乳鐵蛋白在畢赤酵母中正確折疊，并能夠快速的分泌到細(xì)胞外，實現(xiàn)增強(qiáng)乳鐵蛋白的高效表達(dá)，本發(fā)明分別在細(xì)胞內(nèi)使用啟動子FLD1增加分子伴侶HSP70、Ydj1和GrpE的表達(dá)，并驗證了分子伴侶不同組合對乳鐵蛋白表達(dá)量的影響。進(jìn)一步使用組成型啟動子GAP強(qiáng)化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子伴侶BiP、Sec61a的表達(dá)，最后通過將不同分子伴侶進(jìn)行組合優(yōu)化，證明HSP70和Sec61a為最佳組合，獲得一株乳鐵蛋白高效合成的畢赤酵母菌株。本發(fā)明不僅實現(xiàn)提高乳鐵蛋白表達(dá)量的目的，同時也提供了一種增加蛋白表達(dá)水平的方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種高效合成乳鐵蛋白的畢赤酵母，所述的畢赤酵母強(qiáng)化表達(dá)了宿主中的分子伴侶HSP70、Ydj1、GrpE、BiP、Sec61a中的至少一種，所述的宿主異源表達(dá)了人源乳鐵蛋白。