[發明專利]檢測基因甲基化的引物、試劑和試劑盒

有效

• 申請號: 202110412787.2
• 申請日: 2021-04-16
• 公開（公告）號: CN112852934B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 吳亞;邱宇;鄧魏鑫;王維旭;張喆
• 申請（專利權）人: 武漢友芝友醫療科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 周文波

本發明公開了檢測基因甲基化的引物、試劑和試劑盒，涉及甲基化檢測技術領域，本發明公開的引物包括前互補區、第一錯配區、中互補區、第二錯配區以及后互補區。本發明公開的引物通過設置三個互補區和二個錯配區，有效地提高了引物的特異性和靈敏度。

技術領域

本發明涉及甲基化檢測技術領域，具體而言，涉及檢測基因甲基化的引物、試劑和試劑盒。

背景技術

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化系統惡性腫瘤。據2018年全球癌癥數據顯示，全球死亡率最高的癌癥依次為:肺癌(18.4％)、結腸直腸癌(9.2％)、胃癌(8.2％)、肝癌(8.2％)和乳腺癌(6.6％)，而中國癌癥的發病率、死亡率位居全球第一，其中結直腸癌的發病率和死亡率均位居惡性腫瘤第四位，嚴重威脅著人類健康。

以往結直腸癌的高發年齡多在50歲以后，但近年來臨床數據表明我國結直腸癌患者的高發年齡提前至45歲左右，較歐美等國家提前了12-18年。動物脂肪和蛋白質攝入過高，食物纖維攝入不足是直腸癌發生的高危因素，在美國，西方化的飲食習慣會增加結直腸癌的發病率，但由于直腸鏡的篩查已經非常普及，其CRC發病率無明顯增長趨勢。而在中國，人們對直腸癌的篩查意識較低，且常規化體檢中缺乏癌癥早期篩查項目，使我國結直腸癌的發病率和死亡率一直呈上升趨勢。

早期結直腸癌一般無明顯癥狀，多數患者被確診時已處于中晚期，嚴重影響其治療或預后。結直腸腺瘤的癌變通常耗時10年左右，其中0/Ⅰ期結直腸癌的5年存活率高達90％，而Ⅳ期的5年存活率僅為5％-7％，因此，結直腸癌的早期治療成功率很高，早期篩查對后續的治療或預后具有重要意義。此外，腸癌的早期治療還能降低其治療費用，減輕患者負擔。

目前結直腸癌篩查的常用手段包括便潛血檢查，乙狀結腸鏡，直腸指檢和結腸鏡等。結腸鏡可作為結直腸癌篩查的金標準，但該方法具有侵入性，且對操作者技術要求較高，因此限制了起在常規體檢中的應用。糞便潛血檢查作為非侵入式的檢測手段，其靈敏度和特異性亟待提升。因此，需要一種特異性強且靈敏度高的無創檢測方法，有利于結直腸患者的篩查，診斷與治療。

結直腸癌的發生發展機制十分復雜，其癌變過程是多條信號通路和多種基因參與的結果。有研究表明，基因的異常甲基化是導致結直腸癌發生發展的重要原因之一，可作為結直腸癌的診斷依據。DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基在DNA甲基轉移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的催化作用下，以s-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作為甲基供體，通過共價鍵結合的方式獲得一個甲基基團的化學修飾過程，DNA甲基化常發生于CpG島(CpG位點富集的區域)處。研究顯示，SEPT9，NDRG4，VIM，BMP3，SPG20，SDC2等基因的甲基化可作為檢測結直腸癌的分子標志物。

調查表明多數患者更愿意選擇無創的檢測手段進行結直腸癌的篩查，因此利用糞便檢測結直腸癌具有得天獨厚的優勢。目前市面上已有利用糞便檢測結直腸癌基因甲基化的試劑盒，證明DNA甲基化可作為結直腸癌診斷的一種有效途徑。但這些試劑盒存在待改進之處。如糞便樣本的收集、保存和核酸提取方法有待優化；試劑盒檢測靈敏度和特異性無法達到接近結腸鏡的有效診斷率；檢測成本較高等缺陷。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測基因甲基化的引物、試劑和試劑盒。采用本發明提供的引物檢測基因甲基化具有更高的靈敏度和特異性。

本發明是這樣實現的：

一方面，本發明提供一種用于檢測基因甲基化的引物，其具有依次連接的如下區域：前互補區、第一錯配區、中互補區、第二錯配區以及后互補區；

其中，所述前互補區、所述中互補區以及所述后互補區與模板序列互補且每個互補區均覆蓋CpG位點；所述第一錯配區和所述第二錯配區與模板序列不互補且不形成發卡結構。