[發明專利]橡膠樹乳管網絡的分離方法和研究方法

在審

• 申請號: 202110411926.X
• 申請日: 2021-04-16
• 公開（公告）號: CN113375989A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 譚德冠;張家明;付莉莉;馬帥;孫雪飄;韓冰瑩
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/36;G01N1/30;G01N23/04;G01N23/20
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 李偉

本發明提供了一種橡膠樹乳管網絡的分離方法，包括以下步驟：將橡膠樹樹皮樣品采用固定液進行固定，再將得到的橡膠樹樹皮樣品采用酶解液進行酶解；所述酶解液中包括纖維素酶、果膠酶、離析酶、崩潰酶和甘露醇。本申請提供的橡膠樹乳管網絡的分離方法通過采用固定和酶解的方法，實現了橡膠樹乳管網絡的快速、完整分離，具有操作便捷、用時短、乳管解剖學方面信息齊全的優勢。

技術領域

本發明涉及農業組織解剖學技術領域，尤其涉及橡膠樹乳管網絡的分離方法和研究方法。

背景技術

橡膠樹(Hevea brasiliensis Muell-Arg)屬大戟科橡膠屬，是多年生的異花授粉喬木，在熱帶地區廣泛種植；其所產的天然橡膠與石油、煤炭、鐵礦石并列為四大工業原料，是重要的戰略物資，在國民經濟中占有舉足輕重的地位。橡膠樹樹皮乳管是橡膠生物合成和儲存的唯一場所，是決定天然橡膠產量的最重要的結構成分。橡膠樹含有初生和次生兩種類型的乳管。初生乳管存在于橡膠樹的根、花、果實、種子、葉片、幼莖中；次生乳管存在于成齡橡膠樹的樹干樹皮中，是橡膠樹產量的主要來源。

橡膠樹的乳管是由無數個乳管細胞構成的貫通的網絡結構。由于橡膠樹次生乳管的重要性，很多科研人員聚焦于其解剖學研究。橡膠樹樹皮乳管細胞周邊存在薄壁細胞、石細胞、單寧細胞等類型細胞。傳統的研究橡膠樹乳管解剖學方法是以整塊樹皮為研究對象，樹皮塊經固定后進行基于石蠟制片的溴-碘染色法來觀察乳管分化情況，或者經超微制片后在電鏡下觀察乳管細胞內的細胞器變化情況。

以整塊樹皮為研究對象進行顯微或超微結構研究存在以下的缺點：①切片中的乳管網絡結構不全的缺點，導致所獲得的乳管結構特征信息受限制，影響了橡膠樹乳管解剖學研究進展；由于在制片中很難切到在同一平面的乳管網絡，同時其他類型細胞的存在也會對乳管細胞造成一定的干擾，因此在制備好的樹皮切片中只能觀察到個別乳管細胞的形態特征，而不能觀察到整個乳管網絡的形態特征變化，導致切片所提供的乳管結構特征信息受限制；②乳管鑒定實驗操作復雜、耗時；基于石蠟制片的溴-碘染色法是鑒定乳管的經典方法，也是研究乳管分化的最常用方法，但由于樹皮乳管被其他類型細胞所包裹，溴和碘必須在醋酸作介質下在65℃高溫條件下處理2～3d才能將樹皮內部的乳管染上顏色，然后再經過石蠟包埋、切片、粘片、脫蠟、封片等一系列操作才能完成樹皮樣品的制備工作，實驗操作復雜且耗時。

早期，趙修謙報道了一種橡膠樹樹皮乳管網絡的分離方法，該方法是用將樹皮放入10％的氫氧化鉀溶液中煮軟20min，再對乳管進行剝離(趙修謙。巴西橡膠制片法。植物學報，1980，22(1):101-102)。但上述方法中經強堿高溫處理后的乳管其細胞壁會受到一定程度的損傷，同時乳管細胞內的細胞器會變形，所分離到的乳管不能用于超微結構研究。近期，公開號為CN106501035B的中國專利公開了一種快速顯示橡膠樹樹皮乳管的組織化學方法，該方法操作雖然快捷，但其處理對象也是整個樹皮塊，觀察到的是個別的乳管細胞，而不是整個乳管網絡，乳管信息受限制。

發明內容

本發明解決的技術問題在于提供一種橡膠樹乳管網絡的分離方法，該方法可快速分離出橡膠樹乳管網絡的完整結構，以利于橡膠樹乳管顯微結構的研究。

有鑒于此，本申請提供了一種橡膠樹乳管網絡的分離方法，包括以下步驟：

將橡膠樹樹皮樣品采用固定液進行固定，再將得到的橡膠樹樹皮樣品采用酶解液進行酶解；

以100mL酶解液為基準，所述酶解液中包括2～3wt％的纖維素酶、2～3wt％的果膠酶、2～3wt％的離析酶、2～3wt％的崩潰酶、9～13wt％的甘露醇。

優選的，所述固定液為75％的乙醇或4％的戊二醛。

優選的，所述固定的過程具體為：

將橡膠樹樹皮樣品置于固定液，在壓力為350mm條件下真空抽氣15～35min，再固定3～5h。

優選的，所述酶解前還包括：