[發(fā)明專利]一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110408617.7
• 申請(qǐng)日: 2021-04-16
• 公開（公告）號(hào): CN113528595B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚琳;康由發(fā);楊茜雅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站
• 主分類號(hào): C12P17/12
• 分類號(hào): C12P17/12;C07D239/06;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 侯華民

本發(fā)明提供一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，通過將來源于新喀里多尼亞弧菌的ectABC基因簇，導(dǎo)入表達(dá)載體pBAD中，構(gòu)成重組表達(dá)載體pBADVnectABC，并對(duì)重組菌株用L?阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集細(xì)胞，加入含有天冬氨酸鈉、甘油和氯化鉀的PBS緩沖液，進(jìn)行全細(xì)胞催化；離心，收集上清，加入氯仿?正丁醇混勻，劇烈震蕩，離心，取水相；減壓濃縮，并調(diào)節(jié)pH至4.5～5.5，經(jīng)聚酰胺吸附純化，乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮結(jié)晶處理，得到高純度的四氫嘧啶成品，本發(fā)明不僅可在低鹽環(huán)境下生產(chǎn)四氫嘧啶，而且實(shí)現(xiàn)了更加簡(jiǎn)便的四氫嘧啶純化工藝，安全環(huán)保，成本低，四氫嘧啶的純度高達(dá)95.6％，收率達(dá)72％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法。

背景技術(shù)

四氫嘧啶(ectoine，Ec)，是一種源于嗜鹽具有滲透調(diào)節(jié)功能的相容性溶質(zhì)，其作用是幫助嗜鹽微生物維持細(xì)胞質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡。四氫嘧啶不僅是微生物細(xì)胞的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，還是細(xì)胞及大分子物質(zhì)的生物保護(hù)劑，可緩解高滲、高溫、凍融、干燥、輻射和化學(xué)試劑對(duì)蛋白、核酸、生物膜及整個(gè)細(xì)胞的毒害作用。由于四氫嘧啶是所有己知的相容性溶質(zhì)中對(duì)生物細(xì)胞及大分子物質(zhì)保護(hù)效果最好的化合物，所以近年來它在醫(yī)療、酶工業(yè)、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用也日益受到關(guān)注。

目前獲取四氫嘧啶的方法之一是通過嗜鹽微生物發(fā)酵以獲得大量四氫嘧啶。但從嗜鹽微生物中分離純化四氫嘧啶，則需要粉碎菌體或浸泡溶脹使四氫嘧啶釋放出來，同時(shí)菌體破碎后產(chǎn)生的蛋白等雜質(zhì)也增加了下游純化的工藝。近年來，有專利通過重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶，且四氫嘧啶主要在發(fā)酵液中，但此專利采用雙膜系統(tǒng)提取四氫嘧啶，此種方法雖然能耗較低，但菌體和蛋白很容易將膜孔徑堵塞，大大縮短了膜的使用壽命，不符合實(shí)際生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。專利CN202011343592.9一種雙水相萃取結(jié)合離子交換層析提取四氫嘧啶的方法，是從一種嗜鹽菌體中分離純化四氫嘧啶的方法，而通過嗜鹽微生物在高鹽濃度下發(fā)酵對(duì)設(shè)備損耗較大，而且提高了生產(chǎn)成本。專利201310518176.1一種四氫嘧啶高產(chǎn)大腸桿菌工程菌及其應(yīng)用，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后需要進(jìn)行胞內(nèi)/胞外四氫嘧啶的抽提，而其需要分別對(duì)胞內(nèi)和胞外進(jìn)行反復(fù)水相的抽提處理，其操作復(fù)雜且蛋白等雜質(zhì)去除不充分，得率低等不足。因此，本發(fā)明尋求一種新的重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，以實(shí)現(xiàn)更加簡(jiǎn)化的純化工藝，獲得高收率、高純度的四氫嘧啶成品。

發(fā)明內(nèi)容

鑒以此，本發(fā)明提出一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，不僅可在低鹽環(huán)境下生產(chǎn)四氫嘧啶，而且實(shí)現(xiàn)了更加簡(jiǎn)便的四氫嘧啶純化工藝，安全環(huán)保，成本低，四氫嘧啶的純度高達(dá)95.6％，收率達(dá)72％。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，包括如下步驟：

(1)生產(chǎn)四氫嘧啶：將來源于新喀里多尼亞弧菌的ectABC基因簇，通過酶切、連接導(dǎo)入到表達(dá)載體pBAD，構(gòu)成重組表達(dá)載體pBADVnectABC，并導(dǎo)入大腸桿菌BW25113，構(gòu)成重組菌株K-VnectABC(菌種保藏號(hào)：GDMCC No.61577，于中國廣東省的GDMCC-廣東省微生物菌種保藏中心，Escherichia coli K-VnectABC 菌種保藏日期為2021年3月24日)；重組菌株用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)VnectABC 的表達(dá)，離心收集細(xì)胞，加入含有天冬氨酸鈉、甘油和氯化鉀的PBS緩沖液中，形成細(xì)胞懸浮液，進(jìn)行全細(xì)胞催化，生產(chǎn)四氫嘧啶；

(2)純化四氫嘧啶：將全細(xì)胞催化完成后的發(fā)酵液離心，收集上清，加入氯仿-正丁醇混勻，劇烈震蕩，離心，取水相；將水相進(jìn)行減壓濃縮，并調(diào)節(jié)pH 至4.5～5.5后，經(jīng)聚酰胺吸附純化，乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮結(jié)晶處理，得到高純度的四氫嘧啶成品，相比現(xiàn)有的四氫嘧啶生產(chǎn)及純化技術(shù)(如膜系統(tǒng)過濾、電滲析法脫鹽、活性炭脫色等方法)，本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便，安全環(huán)保，成本低、收率高、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)推廣應(yīng)用。