[發(fā)明專利]一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110408617.7
• 申請日: 2021-04-16
• 公開（公告）號: CN113528595B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 譚琳;康由發(fā);楊茜雅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實驗站
• 主分類號: C12P17/12
• 分類號: C12P17/12;C07D239/06;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 侯華民

1.一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)生產(chǎn)四氫嘧啶：將重組菌株K-VnectABC用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)VnectABC的表達，該菌株的保藏號為：GDMCC No.61577；離心收集細胞，加入含有天冬氨酸鈉、甘油和氯化鉀的PBS緩沖液中，形成細胞懸浮液，進行全細胞催化，生產(chǎn)四氫嘧啶；

(2)純化四氫嘧啶：將全細胞催化完成后的發(fā)酵液離心，收集上清，加入氯仿-正丁醇混勻，所述上清、氯仿與正丁醇按照體積比為(22～28):(3～5):1混合，并劇烈震蕩25～35分鐘；離心，取水相；將水相進行減壓濃縮，并調(diào)節(jié)pH至4.5～5.5后，經(jīng)聚酰胺吸附純化，乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮結(jié)晶處理，得到高純度的四氫嘧啶成品。

2.如權(quán)利要求1所述的一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，其特征在于：步驟(1)中每100mM的PBS緩沖液中含有100mM天門冬氨酸鈉、100mM氯化鉀和100mM甘油，pH為7.0～7.5，溫度為28℃。

3.如權(quán)利要求2所述的一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，其特征在于：所述細胞懸浮液在28～32℃，180～220rpm條件下進行催化反應(yīng)24小時，生產(chǎn)四氫嘧啶。

4.如權(quán)利要求1所述的一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，其特征在于：步驟(2)中，所述水相減壓濃縮至原體積的20％，調(diào)節(jié)pH至5.0，經(jīng)聚酰胺樹脂純化，流速為1.8～2.2BV/h，由質(zhì)量濃度為60％乙醇溶液洗脫，流速為0.6～1.5BV/h，收集洗脫液。

5.如權(quán)利要求4所述的一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，其特征在于：所述聚酰胺樹脂的目數(shù)為14～30目。

6.如權(quán)利要求1所述的一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，其特征在于：步驟(1)中，在加入PBS緩沖液前，采用0.85％NaCl溶液洗滌兩次。

7.如權(quán)利要求1所述的一種重組大腸桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶及純化方法，其特征在于：所述濃縮結(jié)晶處理為：將洗脫液濃縮至濃度為50％，從50℃開始降溫結(jié)晶至-4℃結(jié)晶結(jié)束，將粗晶再次重溶于質(zhì)量濃度為60％乙醇溶液中，濾去雜質(zhì)，重復(fù)濃縮結(jié)晶、干燥，得到高純度的四氫嘧啶成品。