[發(fā)明專利]重組人組織型激肽釋放酶及其制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110407194.7
• 申請日: 2021-04-15
• 公開（公告）號: CN113073092A
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉昀;林克
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波瑞林生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/70
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32260
• 代理人: 蔡琳

本發(fā)明屬于生物工程基因領(lǐng)域，具體涉及重組人組織型激肽釋放酶及其制備方法。本發(fā)明將人組織型激肽釋放酶經(jīng)過密碼子優(yōu)化構(gòu)建重組質(zhì)粒，并以大腸桿菌作為宿主進(jìn)行高密度發(fā)酵，最終通過變復(fù)性處理獲得產(chǎn)量較高的人組織型激肽釋放酶，為人組織型激肽釋放酶實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)，使人組織型激肽釋放酶在疾病治療中具有良好的前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程基因領(lǐng)域，具體涉及重組人組織型激肽釋放酶及其制備方法。

背景技術(shù)

蛋白酶在生物理化過程中起著極其重要的作用，自然界中的蛋白酶因氨基酸功能殘基的不同被劃分為四類：絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶(Serine Proteases,又稱SPs)因其在活性位點(diǎn)上的催化絲氨酸殘基而得名。目前人體中已發(fā)現(xiàn)175種絲氨酸蛋白酶，其中絕大多數(shù)為分泌蛋白。經(jīng)典的絲氨酸蛋白酶在C端具有特異性保守催化三聯(lián)體(His、Asp、Ser)結(jié)構(gòu)域，同時(shí)具有包括Ser-his-glu、Ser-lys/His、His-Ser-His和n端Ser等在內(nèi)的多個(gè)活性位點(diǎn)。這類蛋白酶廣泛存在于生物體中，參與細(xì)胞凋亡與分化、胚胎發(fā)育、免疫防御等多種重要的生物代謝與化學(xué)過程，發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。目前研究較多的是消化過程必不可少的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；此外，在消化、凝血、補(bǔ)體等多個(gè)系統(tǒng)中不可或缺的調(diào)節(jié)因子、作為外源性和內(nèi)源性凝血途徑重要組成部分的凝血因子X和凝血因子XI、補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑中的C1r和C1s、凝集素途徑中的MASP都是絲氨酸蛋白酶超家族的重要成員；甚至中性粒細(xì)胞(NSPs)中都存在著絲氨酸蛋白酶，主要發(fā)揮組織降解和微生物殺滅作用；近年來，絲氨酸蛋白酶在癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用也受到廣泛關(guān)注。

激肽釋放酶(KLKs)是一類具有多種生理功能的絲氨酸蛋白酶。“激肽釋放酶”一詞最早是在20世紀(jì)30年代由Werle等人提出，用來描述人類胰腺中能夠產(chǎn)生釋放激肽的物質(zhì)。目前研究表明，KLKs是一個(gè)有15種分泌型的絲氨酸蛋白酶的家族，可以根據(jù)在體內(nèi)分布的差異區(qū)分為兩個(gè)主要的群體：一是血漿激肽釋放酶(也稱為KLK1B)，參與血漿激肽形成；另一個(gè)是組織激肽釋放酶(包括KLK1)，參與組織細(xì)胞分裂素的形成。兩組KLKs在基質(zhì)、理化性質(zhì)和功能特性等方面都有所差異。現(xiàn)有研究結(jié)果表明KLK1對健康的心血管系統(tǒng)很重要，并且KLK1缺乏與心血管疾病和終末器官病理有關(guān)。重要的是，KLK1補(bǔ)給療法在亞洲得到了廣泛的應(yīng)用，在亞洲，KLK1被用于治療從急性缺血性中風(fēng)(AIS)到糖尿病并發(fā)癥(視網(wǎng)膜病變和腎臟疾病)的疾病，這些疾病均涉及微循環(huán)不良或組織缺血。此外，AIS的發(fā)病機(jī)制包括適應(yīng)不良的免疫系統(tǒng)反應(yīng)和復(fù)雜的炎癥途徑均可通過KLK1治療來解決。急性缺血性中風(fēng)(AIS)是全世界死亡和致殘的主要原因，其最嚴(yán)重的形式是由腦部威利斯環(huán)島主要分支的大血管閉塞引起的。西方國家目前可用于大血管閉塞的治療策略涉及通過使用機(jī)械或藥理學(xué)手段(例如組織血漿激活劑tPA)去除有害血塊來快速恢復(fù)血流。KLK1負(fù)責(zé)激肽(緩激肽和激肽)的產(chǎn)生，激肽促進(jìn)局部血管舒張和長期血管形成。此外，KLK1在臨床上已被直接用于治療與局部血流受損有關(guān)的多種疾病，包括AIS。中華人民共和國已批準(zhǔn)從人尿液中分離出一種人KLK1，用于亞急性AIS治療。現(xiàn)有技術(shù)中，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組KLK1，由于酵母為真核細(xì)胞，重組表達(dá)操作復(fù)雜，并且由于種屬差異，KLK1很難直接在酵母中表達(dá)，無法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)量化，使KLK1的應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組KLK1，由于酵母為真核細(xì)胞，重組表達(dá)操作復(fù)雜，并且由于種屬差異，KLK1很難直接在酵母中表達(dá)，無法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)量化，使KLK1的應(yīng)用受到限制的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供的重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，具體技術(shù)方案如下：

重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1，將激肽釋放酶目的基因亞克隆到載體質(zhì)粒上，獲得目的基因重組質(zhì)粒；

S2，將步驟S1中的目的基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，獲得重組KLK1大腸桿菌菌株；