[發明專利]重組人組織型激肽釋放酶及其制備方法

在審

• 申請號: 202110407194.7
• 申請日: 2021-04-15
• 公開（公告）號: CN113073092A
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 葉昀;林克
• 申請（專利權）人: 寧波瑞林生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/70
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務所(普通合伙) 32260
• 代理人: 蔡琳

1.重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1，將激肽釋放酶目的基因亞克隆到pSUMO3載體質粒上，獲得目的基因重組質粒；

S2，將步驟S1中的目的基因重組質粒轉化至大腸桿菌，獲得重組KLK1大腸桿菌菌株；

S3，將步驟S2中的重組KLK1大腸桿菌菌株進行高密度發酵，表達重組SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵體；

S4，將步驟S3中重組SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵體進行變性處理和復性處理，獲得重組人組織型激肽釋放酶。

2.根據權利要求1所述的重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，在步驟S1中，所述激肽釋放酶目的基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，所述激肽釋放酶目的基因通過同源重組處理方法亞克隆到pSUMO3載體質粒上。

3.根據權利要求2所述的重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，在步驟S1中，所述同源重組處理方法包括如下步驟：

(1)利用引物1和引物2獲得線性化激肽釋放酶目的基因，所述引物1的堿基序列如SEQID NO.2所示，所述引物2的堿基序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)利用引物3和引物4獲得線性化pSUMO3質粒，所述引物3的堿基序列如SEQ ID NO.4所示，所述引物4的堿基序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)將步驟(1)中的線性化激肽釋放酶目的基因與步驟(2)中的線性化pSUMO3質粒進行同源重組反應。

4.根據權利要求1所述的重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，在步驟S3中，所述高密度發酵的具體步驟如下：將重組KLK1大腸桿菌菌株接種至搖瓶進行擴大培養后，再轉入發酵罐進行高密度發酵培養。

5.根據權利要求4所述的重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，所述擴大培養的培養基為氨芐抗性的2×YT培養基，培養溫度為37℃，培養基搖床的轉速為220rpm；

所述高密度發酵培養包括下列步驟：將擴大培養后的菌液按1:(50-100)比例接種于經過高溫滅菌過的發酵基礎培養基中進行通氣，攪拌培養，初始培養條件包括：轉速100-120rpm，通氣量20-40L/min，罐壓0.03-0.07MPa，pH6.8-7.2，溫度35-39℃；當細菌密度增加，溶氧低于20％時，提高轉速至200-400rpm，提高通氣量至50-80L/min；當發酵OD600至30以上時，加入誘導劑，同時，將發酵罐溫度由35℃-39℃降為25℃-27℃，繼續培養至發酵結束；所述誘導劑為0.5mM異丙基硫代半乳糖苷。

6.根據權利要求1所述的重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，在步驟S3中，所述重組SUMO3-KLK1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.根據權利要求1所述的重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，在步驟S4中，重組SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵體經過變性處理獲得蛋白變性液，所述蛋白變性液逐滴滴加到劇烈攪拌的復性液中，靜止復性，所述復性液的成分為50mM的pH7.5-8.5Tris-HCl、0-700mM的L-Arg、0-700mM的GuHCl、0-20％的glycerol、0-250mM的NaCl、3.8mM GSH/1.2mM GSSG和0-1800mM的Sorbitol。

8.根據權利要求7所述的重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，所述復性液的成分為50mM的pH8.0 Tris-HCl、50mM的NaCl、500mM的GuHCl、3.8mM GSH/1.2mM GSSG和1800mM的Sorbitol；所述復性溫度為4℃，所述復性的時間為24-48h。

9.根據權利要求1所述的重組人組織型激肽釋放酶的制備方法，其特征在于，在步驟S4中，復性后的蛋白液進行透析、鎳親和層析和反向鎳柱親和層析，獲得純化后的重組人組織型激肽釋放酶。

10.重組人組織型激肽釋放酶，其特征在于，根據權利要求1-9任一項所述的方法制備的重組人組織型激肽釋放酶。