[發明專利]一種卵透明帶結合試驗中的精子計數方法

在審

• 申請號: 202110403651.5
• 申請日: 2021-04-15
• 公開（公告）號: CN113106141A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 廉穎;劉平;喬杰;王瑩;胡靜;李卓;任秀蓮;李悅;王亞朋;王中偉
• 申請（專利權）人: 北京大學第三醫院（北京大學第三臨床醫學院）
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張可

本發明提供一種優化的在卵透明帶結合試驗中對精子的計數方法。所述方法操作簡便，所用試劑易獲取，可顯著降低試驗成本，并解決其因操作復雜，對檢測人員要求過高，使其在臨床中推廣受限的技術問題。

技術領域

本發明涉及一種優化的透明帶結合實驗方法，更為具體的，本發明涉及一種卵透明帶結合試驗中的精子計數方法。

背景技術

不孕癥是指夫妻雙方在12個月或更長時間內頻率正常的無保護性交后未能達到臨床妊娠。在發達國家,不育癥發生率為5.0-8.0%,而在發展中國家則高達5.8-44.2%，其中由于男性因素導致的不孕占40-50%，約有2%的孕男性精液參數未達到標準。目前臨床上對于男性不孕的實驗室診斷主要根據《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（第5版）》，使用計算機輔助精子分析（Computer-aided sperm analysis, CASA）進行精液常規分析，將計算機處理技術和的圖像處理技術結合在一起，通過對圖像中的精子進行全面分析，可檢測精液中精子的密度、活率、活力和精子運動特征等各項量化的指標，從而分析精子的一般狀態及運動特征，并將其作為評價男性生育力的重要依據。但是精子從發生到最終形成受精卵需要經過精子獲能、頂體反應、結合并穿過透明帶、精卵結合等一系列復雜的過程，僅憑對精子形態學指標進行分析，并不能準確反應精子受精能力。因此，臨床上需要對精子功能進行檢測以充分評估男性生育力。隨著輔助生殖技術的發展，特別是卵母細胞胞質內單精子注射技術（Intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的出現和推廣，使得精子功能缺陷的不孕男性生育率提高。但是該技術為侵入性操作，且花費較高，因此充分評估精子功能，把握新技術的應用指征，對不孕男性患者有重大意義。人卵透明帶試驗旨在檢測精子與透明帶結合的能力，作為檢測精子功能的方法之一，為臨床全面評估男性生育能力及制定下一步治療方案提供參考。

人卵透明帶試驗目前主要有兩種方法,一種是半卵透明帶檢測試驗,另一種是精子-透明帶結合試驗。半卵透明帶檢測試驗是將透明帶顯微切割成相等的兩部分,分別與相同密度的待檢測精子和對照精子進行試驗，計數每部分卵子分別結合的卵子，評價待檢精子與卵子透明帶結合的能力。半透明帶結合試驗經顯微切割后，呈現為兩個大小均等的半圓形。將等密度處理好的精液加入后，可能會同時與半透明帶的內外面相結合，因此在進行精子計數時，應按照一個方向逐步對焦，由內而外或由外而內計數，避免重復。由于兩半透明帶來自同一個卵，理論上與精子的結合能力應該一致，一半作為實驗組一半作為對照組，起到了控制變量的作用。精子-透明帶結合試驗是用不同的熒光染料分別標記待檢測精子和對照精子，即待檢測精子用一種熒光染料染色，而對照精子用另一種熒光染料染色，計算結合在同一個卵透明帶上的待檢測精子和對照精子的數量和比值。

然而，利用這兩種方法對精子進行計數時均存在較為明顯的缺點：半卵透明帶檢測試驗是將透明帶顯微切割成相等的兩部分進行對照試驗，其中切割卵子且保持兩部分相等對試驗人員的技術要求過高，而精子-透明帶結合試驗是用不同的熒光染料分別標記精子，計算卵子上結合的待測精子與對照精子的比例進而評判待測精子的結合能力，但是該方法熒光染色劑較昂貴，且操作繁瑣，需要在熒光顯微鏡下觀察計數。因此亟需對現有技術進行改進，使精子的計數更為簡單高效。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種優化的在卵透明帶結合試驗中對精子的計數方法。所述方法操作簡便，所用試劑易獲取，可顯著降低試驗成本，并解決其因操作復雜，對檢測人員要求過高，使其在臨床中推廣受限的技術問題。

具體的，本發明提供的卵透明帶結合試驗中的精子計數方法包括如下步驟：

(1) 精子準備；

(2) 卵子準備；

(3) 配子共培養：

a. 用胚胎轉移管（商品化或用巴斯德吸管拉制）吸取所需數量的卵母細胞，將其轉移至已調好精子受精密度的受精培養液中；

b.在CO₂培養箱內孵育3小時；

c.從受精培養液中回收卵母細胞；