[發明專利]一種高效液相質譜聯用測定血漿中利福平的方法

在審

• 申請號: 202110401110.9
• 申請日: 2021-04-14
• 公開（公告）號: CN113109493A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 郭德應;陶春蕾;許楊;曾虹;湯阿逞
• 申請（專利權）人: 安徽萬邦醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 合肥律眾知識產權代理有限公司 34147
• 代理人: 趙娟

1.一種高效液相質譜聯用測定血漿中利福平的方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1，血漿樣品預處理：

以K2-EDTA為抗凝劑，以利福平-d3為內標；于96深孔板中精密加入50μL的血漿樣品，加入50μL的1μg/mL的內標利福平-d3溶液，混勻后加入200μL有機溶劑甲醇于96深孔板中，渦旋混合；于4℃以4200rpm離心10min，取上層清液50μL至裝有300μL混合有機溶劑的96深孔板中；水按照體積比50：50混合得到的混合物，渦旋混勻；于4℃以4200rpm離心10min后作為測試樣品待檢測；以上過程中除了離心均需于室溫黃光條件下操作；

S2，液相色譜條件：

Welch Μltimate XB-C18，5μm，柱規格為2.1x100mm；色譜柱溫：40℃；流動相A：水/甲酸的體積百分比為100/0.1；流動相B：乙腈；洗液：乙腈/水/甲酸的體積百分比為80/20/0.1；自動進樣器溫度為4℃；梯度洗脫，流速為0.5mL/min，進樣量為5μL，分析時間4.0min；

S3，質譜條件：

離子源為電噴霧離子源，接口電壓為4KV，接口溫度為300℃，DL溫度為250℃，加熱塊溫度為400℃，霧化氣流量為3L/min，干燥氣流量為10L/min，加熱氣流量為10L/min，去簇電壓分別為-18eV的利福平和-27eV的利福平-d3；Q1 Pre偏差分別為-24V的利福平和-24V的利福平-d3；Q3 Pre偏差分別為-40V的利福平和-28V的利福平-d3；正離子方式檢測；掃描方式為多重反應監測；

S4，高效液相色譜-串聯質譜儀測定：

取適量測試樣品注入高效液相色譜-串聯質譜儀中，測試樣品中的利福平和內標利福平-d3的色譜峰，并計算所述血漿樣品中的利福平的濃度；

其中，用于定量分析的離子反應分別為：m/z 823.3→791.30，其為利福平；m/z 826.10→402.10，其為利福平-d3。

2.根據權利要求1所述的高效液相質譜聯用測定血漿中利福平的方法，其特征在于：進一步地，所述梯度洗脫選用二元高壓梯度洗脫，所述二元高壓梯度洗脫程序為：

3.根據權利要求1所述的高效液相質譜聯用測定血漿中利福平的方法，其特征在于：所述步驟S4中，采用內標法，以利福平和內標利福平-d3的峰面積比值帶入標準曲線方程計算所述血漿樣品中的利福平的濃度。

4.根據權利要求3所述的高效液相質譜聯用測定血漿中利福平的方法，其特征在于：所述標準曲線方程的建立包括以下步驟：取190μL空白血漿10份置于聚丙烯管中，以貯備液的形式分別添加10μL濃度分別為0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、4.0μg/mL、12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL、60μg/mL的利福平工作溶液至標樣1、標樣2、標樣3、標樣4、標樣5、標樣6、標樣7、最高定量上限樣本中，分別添加50μL體積分數為50％的甲醇水溶液至雙空白樣本中，混勻后分別向標樣1、標樣2、標樣3、標樣4、標樣5、標樣6、標樣7、最高定量上限樣本、零濃度樣本中加入50μL的1μg/μL的內標利福平-d3溶液，向雙空白樣本中加入50μL的體積分數為50％的甲醇水溶液，混勻后分別向10份樣本中加入200μL甲醇于96深孔板中，渦旋混合，于4℃以4200rpm離心10min，取上層清液50μL至裝有300μL混合有機溶劑的96深孔板中，混合有機溶劑為甲醇：水按照體積比50：50混合得到的混合物，渦旋混勻，于4℃以4200rpm離心10min后分別作為10份標準樣品待檢測；以上過程中除了離心均需于室溫黃光條件下操作；分別取適量標準樣品注入高效液相色譜-串聯質譜儀中，檢測樣品中的利福平和內標利福平-d3的色譜峰，并據此得到標準曲線，以用于計算所述血漿樣品中的利福平的濃度。