[發(fā)明專利]一種用于分析PCB95及其代謝物在雞肝微粒體中代謝行為的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110393679.5
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113063875B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邱靜;廖光琴;張崴
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/70
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 王煥

1.一種用于分析PCB95及其代謝物在雞肝微粒體中代謝行為的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（a）建立雞肝微粒體孵育體系；

（b）將不同濃度的PCB95及其代謝物在雞肝微粒體孵育液中孵育代謝；

（c）以氣相色譜儀和電子捕獲檢測器測定孵育液中PCB95及其代謝物的含量；

（d）根據(jù)定量結(jié)果，分析評價PCB95及其代謝物在雞肝微粒體中的特征代謝行為和毒性差異；所述代謝物包括4-OH-PCB95和4-MeO-PCB95；

步驟（a）建立雞肝微粒體孵育體系包括在冰浴中依次加入雞肝微粒體、pH 7.4 Tris-HCl孵育緩沖溶液于培養(yǎng)瓶中，孵育液總體積為200 μL并混勻，置37℃水浴震蕩預(yù)孵育5min；所述Tris-HCl孵育緩沖溶液含50 mmol Tris-HCl、1 mmol NADPH-Na4、5 mmol MgCl₂；

所述方法還包括提取PCB95及其代謝物的步驟；所述提取包括將孵育液渦旋20-30min，加入MgSO₄和NaCl后再次渦旋5-8 min，然后在8000-10000 rpm條件下離心5-8 min；添加凈化鹽包渦旋1-2 min，在5000-6000 rpm條件下離心5-8 min，然后通過PTFE濾膜過濾；所述凈化鹽包含有MgSO₄、PSA和C18；

色譜條件為：色譜柱：HP-5MS UI 0.25×0.25×30 m ，流速：1 mL/min，

進(jìn)樣體積：1 μl，進(jìn)樣口溫度：300℃，檢測器溫度：300℃，載氣：He，尾吹N₂：1 mL/min；

升溫程序：階段一：初始速率0℃/min，初始溫度60℃，保持1 min；階段二：上升速率40℃/min，上升溫度170℃，保持0 min；階段三：上升速率6℃/min，上升溫度310℃，保持5min；

通過PCB95及其代謝物在雞肝微粒體中的半衰期T_1/2和清除率CL分析評價特征代謝行為以及通過PCB95及其代謝物在雞肝微粒體中代謝的米氏常數(shù)K_m分析評價毒性差異；

半衰期的計算公式為：T_1/2=-0.693/к；其中將0 h的孵育濃度作為100%；然后各時間點濃度與之相比得到剩余底物的百分?jǐn)?shù)量，用此百分?jǐn)?shù)量的自然對數(shù)與孵育時間做線性擬合得出斜率к；

清除率的計算公式為：CL=0.693×孵育液（mL）/[T_1/2（h）×雞肝微粒體（mg）]。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（a）中，所述孵育體系中，雞肝微粒體蛋白濃度范圍為0.1~0.5 mg/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（a）中，所述孵育體系中，雞肝微粒體蛋白濃度為0.1 mg/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（b）中，PCB95的孵育濃度范圍為0~144.26 μg/mL，4-OH-PCB95的孵育濃度范圍為0~11.132 μg/mL，4-MeO-PCB95的孵育濃度范圍為0~55.36 μg/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，PCB95的孵育濃度為0.1~50 μg/mL；4-OH-PCB95的孵育濃度為0.1~10 μg/mL；4-MeO-PCB95孵育濃度為0.1~50 μg/mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（b）中，所述孵育的時間范圍為0~8 h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（b）中，所述孵育的時間范圍為0~6 h。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟（b）后還包括添加乙腈終止反應(yīng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述乙腈的體積為所述孵育液體積的8-10倍。