[發明專利]一種過表達/敲低CSE基因的方法及其在治療人鼻咽癌中的應用

在審

• 申請號: 202110393452.0
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113174404A
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 吳東棟;張倩倩;祁慧雯;王迪;王怡禛;敬米蓉;張艷霞;蔡春波;高熒苒;李彥章;姬新穎
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/60;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 呂洪

1.一種過表達/敲低CSE基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

將CSE基因穩定敲低及穩定過表達人CSE基因質粒轉染人鼻咽癌細胞，通過G418和嘌呤霉素篩選，最終得到穩定敲低和過表達CSE基因的人鼻咽癌細胞。

2.如權利要求1所述的過表達/敲低CSE基因的方法，其特征在于，首先通過藥敏試驗確定最佳遺傳霉素G418和嘌呤霉素濃度，能夠完全殺死細胞的最低G418和嘌呤霉素濃度，具體為：

進行G418藥物濃度篩選前12h，將已培養好的細胞消化離心，按5行10列模型鋪在96孔板中，根據細胞大小形態及生長速度，每孔鋪大約40％即可，置于培養箱中培養；

用完全培養基配制不同濃度的G418，一般從100-1000μg/mL即可，每列每空加入一個濃度的G418，再放入培養箱進行培養；

每天換液，并在顯微鏡下觀察細胞死亡狀況，至細胞剛好全部死亡那列G418的濃度即為該細胞的最適濃度，CNE-1為800μg/mL，C666-1為700μg/mL。

3.如權利要求1所述的過表達/敲低CSE基因的方法，其特征在于，穩定敲低人CSE基因的方法包括如下步驟：

S1：擴增人CSE基因；

S2：對GV102載體中的限制性酶切位點BamHI和HindⅢ進行酶切，形成線性化GV102載體；

S3：將S1和S2產物進行連接構建GV102-CSE載體；

S4：PCR鑒定，擴增人CSE基因，進行瓊脂糖凝膠電泳；

S5：陽性克隆測序，鑒定GV102-CSE載體中人CSE基因正確性；

S6：瞬時轉染：將S3所構建的GV102-CSE載體轉染人鼻咽癌細胞；

S7：穩定轉染：向瞬時轉染的CSE敲低人鼻咽癌細胞中加入嘌呤霉素，進行篩選，構建穩定轉染細胞株。

4.如權利要求1所述的過表達/敲低CSE基因的方法，其特征在于，穩定過表達人CSE基因的方法包括如下步驟：

步驟1：擴增人CSE基因；

步驟2：對GV208載體中的限制性酶切位點BamHI和AgeI進行酶切，形成線性化GV208載體；

步驟3：將步驟1和步驟2產物進行連接構建GV208-CSE載體；

步驟4：PCR鑒定，擴增人CSE基因，進行瓊脂糖凝膠電泳；

步驟5：陽性克隆測序，鑒定GV208-CSE載體中人CSE基因正確性；

步驟6：瞬時轉染：將步驟3所構建的GV208-CSE載體轉染人鼻咽癌細胞；

步驟7：穩定轉染：向瞬時轉染的CSE過表達人鼻咽癌細胞中加入G418，進行篩選，構建穩定轉染細胞株。

5.如權利要求1所述的過表達/敲低CSE基因的方法，其特征在于，對于CSE基因穩定敲低，寡核苷酸編碼靶向人CSE的shRNA和對照shRNA被亞克隆進入GV102質粒載體的HindIII和BamHI限制性酶切位點，通過測序確認序列正確，將sh-CSE載體或空載體轉染入人鼻咽癌細胞中，然后加入嘌呤霉素篩選穩定轉染的細胞株。

6.如權利要求1所述的過表達/敲低CSE基因的方法，其特征在于，對于CSE基因過表達，將人CSE cDNA亞克隆進入GV208質粒載體的BamHI和AgeI限制性酶切位點，通過測序確認序列正確，將GV208-CSE載體或空載體轉染入人鼻咽癌細胞中，然后加入G418篩選穩定轉染的細胞株，以未轉染的人鼻咽癌細胞作為陰性對照組，在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效果。

7.一種如權利要求1所述的過表達/敲低CSE基因的方法在治療人鼻咽癌中的應用，制備的GV102-CSE載體穩定轉染人鼻咽癌細胞后，可使人鼻咽癌細胞中的CSE基因敲低，制備的GV208-CSE載體穩定轉染人鼻咽癌細胞后，可使人鼻咽癌細胞中的CSE基因過表達。