[發明專利]靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體及其獲得方法和用途

有效

• 申請號: 202110392665.1
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113186191B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 黃強;李園園;劉建平;宋夢華;顏志超
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53;G16C10/00
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

本發明公開了一種靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體及其獲得方法和用途。本發明選有可能與TTX結合的DNA適配體Anti?vWF；然后使用堿基T替換Anti?vWF中的非天然堿基獲得其變體Tv?51，并利用分子對接及分子動力學模擬軟件研究Tv?51與TTX的結合過程與模式；最后用微量熱泳動實驗驗證。另外，我們對之前已發現的TTX適配體AI?57進行了優化設計，獲得親和力更高的變體AI?52，測得的平衡解離常數為6.61 nM。這兩個適配體的親和力均高于已報道的TTX適配體。本發明確定的適配體Tv?51和AI?52用于檢測河豚毒素，為開發基于核酸適配體的TTX生物傳感器奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于河豚毒素檢測技術領域，具體涉及靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體及其獲得方法和用途。

背景技術

河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) 是一種主要由河豚魚腸道內共生細菌產生的低分子量生物堿類海洋毒素。人類可能通過食用或接觸受污染的海產品及生活用水而遭受TTX的侵害，該毒素會導致誤食者腹瀉性中毒以及麻痹性中毒；據報道，TTX的毒性約是氰化鈉的100倍，攝入1~2 mg就足以殺死重50 kg的人體(1,2)。因此，檢測海產品或生活用水中的TTX對于人類健康具有重要意義。目前，TTX的檢測方法有小鼠生物檢測法(MBA)(3)、酶聯免疫分析法(ELISA)(4)、高效液相色譜法(HPLC)(5)以及液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)(6)等。然而，這些方法存在檢測靈敏度低、操作復雜、重復性差、設備昂貴、對技術人員要求高或動物倫理等問題；同時，也沒有足夠快速的檢測技術對水樣或中毒生物進行TTX的現場檢測(7)。近年來，基于核酸適配體的生物傳感器制作技術的快速發展，為高效檢測TTX等海洋毒素提供了新的解決方案。

核酸適配體是一種由指數富集的配體系統進化技術 (Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment, SELEX)篩選出的寡核苷酸片段；可折疊成特定的結構，與靶標分子或細胞特異性結合；通常由20-80個核苷酸組成，分子量為6-30 kDa(8)。海洋毒素本身的毒性導致生物體難以產生抗體，因此使用抗體檢測毒素的方法也難以實現；而靶標小分子的核酸適配體可特異性識別或區分小分子間微小的差異。因此，適配體通常可作為化學和生物傳感器的識別元件，廣泛應用于食品和環境監測等領域(9)。生物傳感器是一種以細胞分子或其他生物材料作為敏感元件，結合二維傳感器，通過級聯放大信號對多種化學物質進行檢測的新型檢測技術；具有操作簡單、速度快、靈敏度高、小型化、易于自動化等優點；廣泛應用于藥物篩選、物質安全檢測、疾病診斷等不同領域(10)。把核酸適配體作為生物傳感器的敏感元件，不僅可以降低檢測成本、縮短檢測時間，而且可以提高檢測靈敏度(11)。

綜上，核酸適配體在TTX檢測以及抑制劑制備等領域具有廣闊的應用前景。然而，缺乏高親和性TTX適配體的研究現狀極大限制了其實際的應用。一方面是受到核酸適配體篩選方法的限制，如SELEX篩選方法存在操作復雜、周期長、樣品消耗量大等問題；另一方面，因為適配體與小分子相互作用機制的研究尚不成熟，所以新發展的SELEX技術對TTX這種小分子篩選效率仍然很低，從而導致目前高親和性TTX適配體極少。

因此，本發明獲得的高親和性TTX適配體Tv-51和AI-52，為開發基于適配體的生物傳感器檢測技術與解毒劑藥物奠定基礎，促進TTX適配體在各領域的發展與應用。適配體的產生可分為兩個部分，第一部分采用計算技術模擬適配體Tv-51與TTX分子的結合，并根據適配體AI-57的關鍵結構信息來進行優化設計；第二部分通過實驗驗證Tv-51和AI-52能高親和性結合TTX分子。

發明內容

本發明的目的是提供能夠靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體及其獲得方法和用途，為開發基于適配體的生物傳感器檢測技術與解毒劑藥物奠定基礎。

本發明提供的能夠靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體，其為：