[發(fā)明專利]靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體及其獲得方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110392665.1
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號(hào): CN113186191B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃強(qiáng);李園園;劉建平;宋夢華;顏志超
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;G01N33/53;G16C10/00
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1.一種靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體，其特征在于，其序列為SEQ.ID.NO1所示，記為：Tv-51。

2.如權(quán)利要求1所述靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體的獲得方法，其特征在于，具體步驟為：

第一步：通過分析河豚毒素與鈉離子通道的結(jié)合模式，尋找可與其結(jié)合的核酸適配體，其序列為SEQ.ID.NO1所示；

第二步：進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，獲取DNA適配體Tv-51的穩(wěn)定構(gòu)象；

第三步：使用AutoDock4.2對接適配體Tv-51與TTX；

第四步：針對Tv-51進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬以獲得穩(wěn)定的復(fù)合物構(gòu)象；

第五步：采用微量熱泳動(dòng)(MST)實(shí)驗(yàn)測定適配體Tv-51與TTX的結(jié)合能力；

對于每一組MST實(shí)驗(yàn)，利用梯度稀釋法1:1稀釋TTX溶液至16個(gè)梯度，這16組梯度稀釋液用于16根毛細(xì)管的上樣；另外，每根毛細(xì)管中適配體的濃度固定，并用熒光標(biāo)記于3’端；適配體與靶標(biāo)小分子的偶聯(lián)會(huì)影響熱泳動(dòng)的過程，從而導(dǎo)致熱泳動(dòng)之后熒光信號(hào)值發(fā)生變化；通過測量在不同結(jié)合程度下，樣品溶液在MST過程中熒光信號(hào)的變化，擬合得到關(guān)于該結(jié)合反應(yīng)的解離平衡常數(shù)，即K_d值。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體的獲得方法，其特征在于，第一步中所述通過分析河豚毒素與鈉離子通道的結(jié)合模式，尋找可與其結(jié)合的核酸適配體，具體過程如下：

TTX結(jié)構(gòu)含有多個(gè)羥基和1個(gè)胍基，且在中性條件下TTX帶正電；可見，TTX具有理想的氫鍵供體和受體，且易結(jié)合酸性氨基酸；而鈉離子通道口既為TTX提供了大小合適的空腔，又具有酸性氨基酸構(gòu)成的“DEE位點(diǎn)”；由此確定，在尋找可能與其結(jié)合的適配體時(shí)，滿足如下條件：該適配體具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和大小適合的結(jié)合位點(diǎn)，以容納TTX；在空間構(gòu)象中，該適配體的結(jié)合位點(diǎn)富含能與羥基、胍基形成氫鍵相互作用的N、O原子，以緊密結(jié)合TTX；

通過對收集的適配體進(jìn)行二維或三維結(jié)構(gòu)的比較，初步獲得可能與TTX結(jié)合的DNA適配體為Anti-vWF；把Anti-vWF中的兩個(gè)非天然堿基替換為胸腺嘧啶脫氧核苷酸，獲得適配體變體，并命名為Tv-51；然后預(yù)測適配體Tv-51的二維和三維結(jié)構(gòu)；該適配體結(jié)構(gòu)擁有三個(gè)莖環(huán)，其中一個(gè)莖環(huán)保留原適配體的迷你發(fā)卡，這有利于Tv-51結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體的獲得方法，其特征在于，第二步中所述進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬、獲取DNA適配體Tv-51的穩(wěn)定構(gòu)象的具體過程如下；

采用GROMACS-5.1.4分子動(dòng)力學(xué)軟件包、AMBER99bsc1力場及SPC水模型對模擬體系進(jìn)行建模；在模擬系統(tǒng)中，把適配體Tv-51置于水盒子的中心，且距水盒子表面距離大于另外，插入鈉離子和氯離子使溶液環(huán)境保持中性，并達(dá)到所需的離子濃度；模擬過程采用周期性邊界條件，靜電和范德華相互作用分別采用PME和Cut-off方法計(jì)算，截?cái)嗑嚯x均為所有化學(xué)鍵均受LINCS算法約束；其中，積分時(shí)間步長為1～3fs；具體過程為：首先，利用最速下降算法對模擬系統(tǒng)進(jìn)行能量最小化；然后，采用V-rescale恒溫器控制系統(tǒng)平衡溫度，Berendsen壓力耦合平衡壓強(qiáng)；最后，對體系進(jìn)行時(shí)間長度不少于50ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，以獲得適配體Tv-51的穩(wěn)定構(gòu)象。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述靶向河豚毒素的高親和性DNA適配體的獲得方法，其特征在于，第三步中所述使用AutoDock4.2對接適配體Tv-51與TTX，具體過程如下：

使用AutoDock4.2進(jìn)行Tv-51與TTX的分子對接，所謂分子對接是指利用配體分子與受體分子間的幾何匹配和能量匹配而相互識(shí)別的過程；這里所述分子對接具體是把Tv-51作為受體、TTX作為配體進(jìn)行半柔性對接。