[發明專利]用于治療腫瘤的壁蛻膜間充質干細胞培養基、共培方法

有效

• 申請號: 202110392393.5
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113322228B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 劉小翠;唐淑艷;鄧燕蓮;蒙燕瑤;雅思敏;楊景利;王進輝
• 申請（專利權）人: 廣東唯泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/09;A61P35/00;A01N1/02
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 李素蘭;何鍵云

1.壁蛻膜間充質干細胞培養基，其特征在于，所述壁蛻膜間充質干細胞培養基由壁蛻膜間充質干細胞和選擇培養基組成；

其中，所述選擇培養基為含有體積濃度8~12%血清替代物、0.5~1mol /ml L-谷氨酰胺、18~25 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、16~22ng/ml表皮生長因子和6~12 ng/ml干細胞生長因子的DMEM無血清培養基。

2.如權利要求1所述的壁蛻膜間充質干細胞培養基，其特征在于，所述壁蛻膜間充質干細胞的制備方法，包括以下步驟：

S11、將壁蛻膜組織剪成1~4 mm³的組織塊，用組織清洗液清洗組織塊；

S12、清洗后用組織消化液在恒溫振蕩下消化組織塊，終止消化，過濾，離心，保留沉淀，所述組織消化液為含有體積濃度40~60% Tryple-EDTA酶和8～12mg/mlⅡ型膠原酶的高糖DMEM培養基；

S13、用生理鹽水清洗沉淀并將沉淀重懸，離心，去除上清液，加入選擇培養基重懸，得到PMSCs懸液；

S14、將PMSCs懸液接種至培養瓶中，在培養箱中進行原代培養，計為P0代；

S15、當細胞融合度大于80%時，消化，過濾、離心，采用選擇培養基重懸沉淀進行傳代培養；

S6、收集Pn代的壁蛻膜間充質干細胞，消化，離心，去除上清液，將凍存液加入沉淀中，降溫凍存置于液氮罐中保藏，n≥2。

3.如權利要求2所述的壁蛻膜間充質干細胞培養基，其特征在于，步驟S11中，所述組織清洗液由以下體積百分比原料配制而成：0.8~1.5%青鏈霉素合劑，50~55%紅細胞裂解液，44~49%的生理鹽水，所述生理鹽水為質量分數為0.8~1%。

4.如權利要求2所述的壁蛻膜間充質干細胞培養基，其特征在于，步驟S12中，組織消化液在溫度為36~39℃下與組織塊振動1.5~4h，振蕩速度為150~200rpm/min；

采用選擇培養基來終止消化，選擇培養基的體積為消化液體積的3~6倍；

采用孔徑為100μm的濾網來過濾；

離心速度為1200~1400rpm/min，離心時間為5~7min。

5.如權利要求2所述的壁蛻膜間充質干細胞培養基，其特征在于，步驟S15中，當細胞融合度大于80%時，采用PBS緩沖液洗滌細胞表面至少2次；

采用細胞消化液消化3~6min，采用選擇培養基來終止消化；

采用孔徑為100μm的濾網來過濾；

離心速度為1200~1400rpm/min，離心時間為5~7min。

6.如權利要求2所述的壁蛻膜間充質干細胞培養基，其特征在于，步驟S16中，在收集壁蛻膜間充質干細胞之前，還包括：對壁蛻膜間充質干細胞進行表面抗體標記檢測，當CD73、CD90和CD105的陽性指標同時99%時，才收集壁蛻膜間充質干細胞；

收集P3代的壁蛻膜間充質干細胞，采用胰酶消化P3代的壁蛻膜間充質干細胞，離心，去除上清液，將凍存液加入沉淀中，降溫凍存置于液氮罐中保藏。

7.如權利要求2所述的壁蛻膜間充質干細胞培養基，其特征在于，步驟S16中，所述凍存液為含有體積濃度18~25% Cryosure-DEX-40的無血清完全培養基；

凍存細胞密度為1.5×10⁶~2.5×10⁶個/ml。

8.壁蛻膜間充質干細胞培養基與腫瘤細胞的共培養方法，其特征在于，包括：

將權利要求1~7任一項所述的壁蛻膜間充質干細胞培養基置于Transwell小室的上室中培養；

將腫瘤細胞置于Transwell小室下室中培養；

將載有壁蛻膜間充質干細胞的上室放入孔板內與下室腫瘤細胞共培養。