[發明專利]耐輻射基因工程菌Deino-dsrA及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202110392388.4
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113106048B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 肖方竹;何淑雅;彭國文;朱琦琦;羅佳琦;劉軍
• 申請（專利權）人: 南華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C02F3/34;C12R1/01;C02F101/20
• 代理公司: 長沙歐諾專利代理事務所(普通合伙) 43234
• 代理人: 歐穎;張文君

本發明提供了一種耐輻射基因工程菌Deino?dsrA及其構建方法與應用。所述構建方法包括：以含有還原基因dsrA的基因組DNA為擴增模板，進行PCR擴增，PCR產物經純化回收得到目的基因dsrA；將目的基因dsrA和pRADK質粒經核酸內切酶NdeⅠ和核酸內切酶BamHⅠ雙酶切并純化回收，用連接酶連接得到重組載體pRADK?dsrA；將所述重組載體pRADK?dsrA轉化入耐輻射奇球菌中構建耐輻射基因工程菌Deino?dsrA，進行PCR鑒定，篩選出基因擴增為陽性的菌株。本發明構建的耐輻射基因工程菌Deino?dsrA應用于低濃度鈾污染水體修復領域，鈾的富集率可以達到90％以上，具有富集效果好、成本低、對環境友好等優點。

技術領域

本發明屬于微生物修復處理技術領域，具體涉及一種耐輻射基因工程菌Deino-dsrA和構建方法，及其在鈾污染水體修復中的應用。

背景技術

鈾是一種天然放射性元素，廣泛分布在巖石和土壤中。近年來，核工業迅速發展，鈾作為重要的核工業原料，其需求量日益增加，與此同時，鈾導致的水體污染越來越受到重視。水體中鈾的來源主要包括鈾礦開采、冶煉及加工，核電站異常事故導致的鈾泄露，核武器的生產、試驗及貧鈾武器的使用等。鈾兼備化學毒性和放射毒性兩方面的危害，可通過呼吸道和消化道進入體內，易溶性鈾化合物還可經無傷的皮膚進入體內，從而產生內照射和化學毒性，可對人的腎臟、免疫系統、神經系統及生育能力產生損害，并可能導致基因突變和癌癥的發生。目前含鈾廢水中鈾的凈化方法主要包括：化學沉淀、吸附、離子交換、溶劑萃取、生物處理等。由于物理化學處理方法的經濟性和有效性低，微生物處理因其廉價、高效、易于培養等特點成為優選方法。

耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans，DR)是一種球菌或桿狀非孢子菌，無致病性，具有極強的抗輻射、抗氧化和DNA損傷修復能力，被認為是地球上最耐輻射的微生物。耐輻射奇球菌對干燥、電離輻射、氧自由基(ROS)和有毒化學物質等都具有很強的抵抗能力，目前已應用于去除放射性核污染廢水中的鈷，鐵等重金屬離子。野生型耐輻射奇球菌對鈾具有一定的富集作用，但仍存在富集率不高的缺點，無法滿足大規模工業化應用需求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種采用轉基因方式構建的耐輻射基因工程菌Deino-dsrA與構建方法，及其在鈾污染水體修復中的應用，所述耐輻射基因工程菌Deino-dsrA具有高還原性、強輻射抗性及較高的鈾富集率，應用于鈾污染水體修復領域具有效果好、成本低、對環境友好等優勢。

為了實現上述目的，本發明提供了一種耐輻射基因工程菌Deino-dsrA的構建方法，包括:

(1)以含有還原基因dsrA的基因組DNA為擴增模板，進行PCR擴增，PCR產物經純化回收得到目的基因dsrA；

(2)將目的基因dsrA和pRADK質粒經核酸內切酶NdeⅠ和核酸內切酶BamHⅠ雙酶切并純化回收，用連接酶連接得到重組載體pRADK-dsrA；

(3)將所述重組載體pRADK-dsrA轉化入耐輻射奇球菌中構建耐輻射基因工程菌Deino-dsrA，進行PCR鑒定，篩選出基因擴增為陽性的菌株。

在一種具體的實施方式中，步驟(1)中，所述PCR擴增的引物核苷酸序列如下：

上游引物dsrA-F序列為：

5’-CCCTGCAGGTCGAATCGGATCCCCAAGGCAGGCTTCAG-3’，

下游引物dsrA-R序列為：

5’-CTCACAGGAGGACCCCATATGCATGTGGAGGTAGGCA-3’；