[發(fā)明專利]一種腦轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的CRISPR/Cas9文庫高通量篩選方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110390689.3
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN112921072A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張劍;林明曦;金奕滋
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6809
• 分類號: C12Q1/6809;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31287
• 代理人: 于曉菁

本發(fā)明公開了一種腦轉(zhuǎn)移相關(guān)候選基因的CRISPR/Cas9文庫高通量篩選方法，該方法包括構(gòu)建腦轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的sgRNA文庫，將sgRNA文庫進(jìn)行慢病毒包裝，感染穩(wěn)定表達(dá)CAS9蛋白的宿主細(xì)胞，并篩選以獲得穩(wěn)定表達(dá)sgRNA文庫的細(xì)胞，然后，將慢病毒感染后的細(xì)胞接種于免疫缺陷的小鼠顱內(nèi)及脂肪墊，最后，將顱內(nèi)成瘤及皮下成瘤的腫瘤組織取出，提取基因組DNA后，對sgRNA的靶向區(qū)進(jìn)行二代測序建庫，通過篩選前后sgRNA的豐度變化，進(jìn)而找出腦轉(zhuǎn)移相關(guān)候選基因。該方法建立了腦轉(zhuǎn)移相關(guān)基因高通量篩選技術(shù)，能夠準(zhǔn)確、高效地挖掘調(diào)控腦轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，為腦轉(zhuǎn)移預(yù)防和治療提供新靶點、新途徑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于癌癥診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種腦轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的CRISPR/Cas9文庫高通量篩選方法。

背景技術(shù)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)這兩個組分組成。sgRNA可以識別帶有PAM(protospacer adjacent motif)序列的互補序列，Cas9蛋白可以對靶DNA序列進(jìn)行切割，因此Cas9/sgRNA系統(tǒng)可以通過sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白識別并剪切帶有sgRNA靶點的特異性雙鏈DNA，導(dǎo)致基因序列的插入或缺失，最終實現(xiàn)基因的定向編輯。CRISPR/Cas9文庫是針對每個基因設(shè)計3-10條的sgRNA，利用芯片一次性合成針對數(shù)百甚至數(shù)萬基因的sgRNA庫，經(jīng)過慢病毒包裝后以低感染復(fù)數(shù)感染穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的宿主細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)暮Y選條件下測試篩選前后sgRNA的豐度變化，進(jìn)而找出關(guān)鍵基因。CRISPR/Cas9文庫篩選技術(shù)可以針對多個基因?qū)崿F(xiàn)高通量的篩選，高效、快捷地篩選出研究者所需的關(guān)鍵基因。

目前，CRISPR/Cas9文庫篩選技術(shù)多應(yīng)用于：(1)體外加藥篩選。將sgRNA文庫包裝成慢病毒后感染穩(wěn)定表達(dá)Cas9的宿主細(xì)胞，而后將細(xì)胞培養(yǎng)于含有不同藥物或不同藥物濃度的培養(yǎng)基內(nèi)，加藥篩選培養(yǎng)一定時間后，測試篩選前后sgRNA的豐度變化。體外加藥篩選可以篩選耐藥/增敏基因，驗證藥物與基因所在信號通路之間的相互影響；(2)小鼠皮下瘤模型篩選腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因。將sgRNA文庫包裝成慢病毒后感染穩(wěn)定表達(dá)Cas9的宿主細(xì)胞，而后將細(xì)胞接種于免疫缺陷小鼠的皮下，待接種的細(xì)胞形成皮下瘤后，將皮下瘤取下并提取DNA，測試接種前后sgRNA的豐度變化。

肺癌、乳腺癌、黑色素瘤發(fā)生腦轉(zhuǎn)移(Brain Metastasis,BM)的患者，由于缺少有效的治療手段，預(yù)后極差。面對腫瘤的腦轉(zhuǎn)移，目前手術(shù)、立體定向放療、全腦放療等局部治療為腦轉(zhuǎn)移的一線治療方法，但由于其對影像學(xué)上不可見的潛在病灶的控制率差，局部治療后顱內(nèi)進(jìn)展的發(fā)生率高。而全身系統(tǒng)治療，如卡培他濱、替莫唑胺等，在腦轉(zhuǎn)移中的治療地位并不明確。臨床醫(yī)師面對顱內(nèi)進(jìn)展往往“束手無策”，顱內(nèi)進(jìn)展所致的死亡率高達(dá)37％。這提示腦轉(zhuǎn)移問題——闡明可能機(jī)制、找到潛在干預(yù)措施是目前乳腺癌研究的重中之重。

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移需經(jīng)歷從原發(fā)灶到轉(zhuǎn)移灶的侵襲-轉(zhuǎn)移級聯(lián)過程。首先腫瘤細(xì)胞突破基膜侵入周圍基質(zhì)，而后進(jìn)入脈管系統(tǒng)到達(dá)轉(zhuǎn)移部位，并最終增殖形成臨床可檢測到的轉(zhuǎn)移克隆灶。其中克隆灶形成是一個極端低效的過程，絕大部份細(xì)胞不能很好地適應(yīng)轉(zhuǎn)移灶的組織微環(huán)境。在其腦轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中細(xì)胞是如何適應(yīng)顱內(nèi)微環(huán)境的，此機(jī)制至今未明，研究也極少。顯而易見，腦轉(zhuǎn)移灶與乳腺原發(fā)灶的代謝微環(huán)境截然不同，轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞要在新的微環(huán)境存活，首先需要代償機(jī)制以適應(yīng)新的微環(huán)境。

但目前并未有研究者提出如何將CRISPR/Cas9文庫篩選技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的腦轉(zhuǎn)移的研究中。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種通過CRISPR/Cas9文庫篩選技術(shù)獲得腦轉(zhuǎn)移相關(guān)候選基因的方法。該方法建立了腦轉(zhuǎn)移相關(guān)基因高通量篩選技術(shù)，拓寬了CRISPR/Cas9文庫的使用范圍，能夠準(zhǔn)確、高效地挖掘調(diào)控腦轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，為腦轉(zhuǎn)移預(yù)防和治療提供新靶點、新途徑。

本發(fā)明提供了一種腦轉(zhuǎn)移相關(guān)候選基因的CRISPR/Cas9文庫高通量篩選方法，包括以下步驟，