[發明專利]一種腦轉移相關基因的CRISPR/Cas9文庫高通量篩選方法在審
| 申請號： | 202110390689.3 | 申請日： | 2021-04-12 |
| 公開（公告）號： | CN112921072A | 公開（公告）日： | 2021-06-08 |
| 發明（設計）人： | 張劍;林明曦;金奕滋 | 申請（專利權）人： | 復旦大學附屬腫瘤醫院 |
| 主分類號： | C12Q1/6809 | 分類號： | C12Q1/6809;C12Q1/6886;C12N15/11 |
| 代理公司： | 上海容慧專利代理事務所(普通合伙) 31287 | 代理人： | 于曉菁 |
| 地址： | 200032 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 轉移 相關 基因 crispr cas9 文庫 通量 篩選 方法 | ||
1.一種腦轉移相關候選基因的CRISPR/Cas9文庫高通量篩選方法，其特征在于，包括以下步驟，
步驟S1、構建腦轉移相關基因的sgRNA文庫：
步驟S2、將sgRNA文庫進行慢病毒包裝，感染穩定表達CAS9蛋白的宿主細胞，并篩選以獲得穩定表達sgRNA文庫的細胞；
步驟S3、將慢病毒感染后的細胞接種于免疫缺陷的小鼠顱內及脂肪墊；
步驟S4、將顱內成瘤及皮下成瘤的腫瘤組織取出，提取基因組DNA后，對sgRNA的靶向區進行二代測序建庫，通過比較前后sgRNA的豐度變化，篩選出腦轉移相關候選基因。
2.根據權利要求1所述的高通量篩選方法，其特征在于，所述腦轉移相關基因為在腦轉移灶與腫瘤原發灶中差異表達的基因，如表1中所示。
3.根據權利要求1所述的高通量篩選方法，其特征在于，所述步驟S1包括以下步驟，
(a)提供核酸構建物Z1，所述的核酸構建物Z1具有以下結構：
L-N20-R
其中，
L為位于腦轉移相關基因的sgRNA的編碼序列上游的左同源臂序列，
N20為腦轉移相關基因的sgRNA編碼序列，
R為位于腦轉移相關基因的sgRNA的編碼序列下游的右同源臂序列；
(b)以所述的核酸構建物Z1為模板，進行PCR擴增，從而獲得擴增產物；
(c)將所述擴增產物與經線性化的表達載體混合，并用Gibson assembly法進行連接，從而形成連接產物；
(d)將所述連接產物轉化大腸桿菌，從而獲得轉化子，并從所述轉化子中抽提質粒，從而獲得所述的腦轉移相關基因的sgRNA文庫。
4.根據權利要求3所述的高通量篩選方法，其特征在于，所述左同源臂L的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示，右同源臂R的核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示。
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