[發明專利]一種腫瘤新生抗原特異性腫瘤浸潤淋巴細胞共培養方法

在審

• 申請號: 202110390264.2
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN113106062A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 孟東;朱毅;蹤家武;吳直江;戴小梅;姚轉
• 申請（專利權）人: 賾譽（上海）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0781
• 分類號: C12N5/0781;C12N5/0783
• 代理公司: 池州市卓燊知識產權代理事務所(普通合伙) 34211
• 代理人: 蒙紹嵩

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其為一種腫瘤新生抗原特異性腫瘤浸潤淋巴細胞共培養方法，其特征在于，包括以下步驟：S1，腫瘤新生抗原制備：分別取肺癌(N1)、胰腺癌(N2)、膽管癌(N3)、三陰乳腺癌(N4)、黑色素瘤腫瘤(N5)組織分離腫瘤細胞，取相應個體的正常組織，使用全外顯子組測序，正常組織與腫瘤組織測序結果比較，以確定所有氨基酸突變，然后設計“包含所有突變肽序列”的基因構建物，按突變基因編碼的新生抗原合成長鏈多肽，本發明通過設計腫瘤新生抗原特異性腫瘤浸潤淋巴細胞共培養方法的收獲的TIL細胞，能夠有效的殺傷自體腫瘤靶細胞，能誘導免疫細胞多靶點、無癌種限制、有免疫記憶功效。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種腫瘤新生抗原特異性腫瘤浸潤淋巴細胞共培養方法。

背景技術

腫瘤浸潤淋巴細胞免疫療法，早在86年，美國國家癌癥研究所(NCI)的SteveRosenberg率先開發并用于治療部分實體瘤(全球約90％的癌癥是實體瘤)，截止2019年臨床研究結果表明66例不可切除黑色素瘤患者的ORR(客觀反應率)為38％(2例CR、23例PR)，DCR(疾病控制率)為80％，TIL療法在黑色素瘤、宮頸癌、頭頸癌、肺癌、乳腺癌、膽管癌、結直腸癌的臨床療效令人矚目，典型病例：1例晚期乳腺癌42個月無瘤生存、1例化療無效的晚期膽管癌獲10年幸存、1例結直腸癌案例TIL治療后肺部7個轉移灶中6個消失，4年后病情無進展、PD-1治療腫瘤后癌癥進展的非小細胞肺癌接受TIL治療13位患者中2位完全緩解(CR)達一年。

基因突變常被認為是誘發癌癥的根本原因，如KRAS基因突變是一個非常頑固，幾乎沒有藥物可以降服，22％的癌癥患者都有KRAS基因突變，尤其是胰腺癌(68％)、膽管癌(27％)和肺癌(17％)，但TIL免疫細胞療法帶來了曙光，使化療失敗者，獲得新生，所以，美國加州Lovance，美國食品藥品管理局(FDA)授予候選療法LN-145突破性治療指定，用于治療化療后復發轉移性或持久性宮頸癌。

以往的研究表明，除黑色素瘤外，不是所有瘤種的TIL細胞都具有高的特異識別能力，國內TIL研究九十年代就緊跟國際潮流，起步雖較早，因多種原因，大多臨床研究都沒達到預期效果，究其原因，取樣困難(有些腫瘤組織樣品易受污染，如腸癌受大腸桿菌污染)，腫瘤組織中分離到的TIL細胞量少(大部分是膠原)，擴增時間長(50天以上)，漫長的擴增時間致使細胞擴增率、殺傷腫瘤活性顯著下降，大部分腫瘤來源的TIL細胞識別能力低下，研究者加用100Gy照射過自體腫瘤細胞(作為抗原)加入培養系統中，使TIL細胞擴增率、對自體腫瘤細胞的殺傷活性顯著提高，可恢復原有的高抑瘤水平。

2014年5月，《Scinence》報道用體外擴增的能特異識別癌細胞的淋巴細胞(TIL)，成功治愈一例惡性晚期膽管癌患者。極端難治性的膽管癌在多種化療方案后，病情依然迅速進展，而參加一項美國國家癌癥中心的TIL細胞治療臨床試驗，從該患者取出一個肺轉移灶，得到足夠數量的TIL細胞，并拿一定數量的腫瘤組織和正常組織，做全外顯子基因測序比較，發現有26個有意義的基因突變，用所有基因突變導致的異常蛋白片段進行人工合成，然后將患者腫瘤組織中分離出來的淋巴細胞(TIL)與攜帶有這些異常蛋白片段的細胞共培養，發現部分T細胞確能識別其中一個異常蛋白ERBB2IP，經體外活化擴增重新回輸到患者體內，第一個療程回輸細胞里，具有特異識別能力的TIL細胞大約占25％，細胞回輸后，病人的腫瘤開始縮小，病情穩定了18個月后腫瘤再次進展，必須進行第二個療程治療，再次取樣的TIL細胞具有95％特異性識別能力，細胞回輸后發現患者體內各處病灶，均再次明細縮小，一段時間后，最終達到完全緩解，后繼續用常規免疫細胞(CIK)療效穩定數年。