[發(fā)明專利]一種腫瘤新生抗原特異性腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110390264.2
• 申請(qǐng)日: 2021-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN113106062A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟東;朱毅;蹤家武;吳直江;戴小梅;姚轉(zhuǎn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 賾譽(yù)（上海）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0781
• 分類號(hào): C12N5/0781;C12N5/0783
• 代理公司: 池州市卓燊知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 34211
• 代理人: 蒙紹嵩

1.一種腫瘤新生抗原特異性腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，腫瘤新生抗原制備：分別取肺癌(N1)、胰腺癌(N2)、膽管癌(N3)、三陰乳腺癌(N4)、黑色素瘤腫瘤(N5)組織分離腫瘤細(xì)胞，取相應(yīng)個(gè)體的正常組織，使用全外顯子組測(cè)序，正常組織與腫瘤組織測(cè)序結(jié)果比較，以確定所有氨基酸突變，然后設(shè)計(jì)“包含所有突變肽序列”的基因構(gòu)建物，按突變基因編碼的新生抗原合成長(zhǎng)鏈多肽，并且這些突變肽呈遞在淋巴細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)上，接著將序列組合成“串聯(lián)的微型基因”，并將其插入TIL細(xì)胞上，合成的腫瘤新生肽抗原分別為：N1腫瘤新生肽抗原、N2腫瘤新生肽抗原、N3腫瘤新生肽抗原、N4腫瘤新生肽抗原、N5腫瘤新生肽抗原；

S2，TIL細(xì)胞與腫瘤新生抗原的共培養(yǎng)：

1)從腫瘤組織中提取TIL細(xì)胞及活化；

2)TIL細(xì)胞的的大容量培養(yǎng)擴(kuò)增；

3)收獲的TIL細(xì)胞檢定：收獲細(xì)胞的無菌、內(nèi)毒素、支原體按中國(guó)藥典III部檢定，均應(yīng)合格；

4)TIL細(xì)胞殺傷自體腫瘤靶細(xì)胞檢定：10:1(效靶比)作用24小時(shí)，殺傷率～80-100％；

5)TIL細(xì)胞中記憶性T細(xì)胞檢定：≥65％。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤新生抗原特異性腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述S2中從腫瘤組織中提取TIL細(xì)胞及活化三維具體步驟如下：

S01：手術(shù)獲取組織，在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)用手術(shù)剪刀分離組織塊為1mm碎塊置50ml離心管內(nèi)，加入0.05％膠原酶II型、0.002％I型DNA酶液25ml，消化2～8小時(shí)，無菌濾網(wǎng)去除未消化的組織塊，清洗離心2次，F(xiàn)icoll密度梯度離心法收集富含淋巴細(xì)胞(TIL)層和腫瘤細(xì)胞層；

S02：以“CD3單克隆抗體(50μg)”8ml包被T75培養(yǎng)瓶置4-8℃24小時(shí)后，使用時(shí)吸去包被液待用；

S03：20ml外周血分離得血漿(不需滅活)；

S04：取TIL細(xì)胞(3-5×106)置入包被的T75培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)液30ml(AIM-V無血清培養(yǎng)基中含0.1mg N1腫瘤新生肽抗原、注射用重組人白介素-2(IL-2)、重組人白介素-15(IL-15)、重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)三磷酸腺苷二鈉注射液(ATP)、注射用輔酶A)、自體血漿10％(細(xì)胞因子均為1000U/離心管內(nèi)ml)；

S05：5天，補(bǔ)加0.1mgN1-5腫瘤新生肽抗原。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤新生抗原特異性腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述S2中TIL細(xì)胞的的大容量培養(yǎng)擴(kuò)增的具體步驟如下：

S06：72小時(shí)后誘導(dǎo)的細(xì)胞補(bǔ)液30ml完全培養(yǎng)液和自體血漿10％；

S07：第5天轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)瓶×1；

S08：第10天轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)瓶×2；

S09：第14天轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)瓶×4，補(bǔ)液總量達(dá)1000ml；

S10：第17天轉(zhuǎn)入容量為2000ml培養(yǎng)袋×2，各袋補(bǔ)液總量達(dá)1000ml；

S11：第20天各培養(yǎng)袋補(bǔ)液總量達(dá)4000ml培養(yǎng)袋×4；

S12：第25天各培養(yǎng)袋補(bǔ)液總量達(dá)8000ml培養(yǎng)袋×4；

S13：第30天可以開始收集細(xì)胞，TIL細(xì)胞總量≥5×1010。