[發(fā)明專利]一種基于肽段同位素稀釋質(zhì)譜法的IgG抗體定值方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110390063.2
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN113125599B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 米薇;戴新華;胡志上;王越珉;游吳凱
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量科學(xué)研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/86;G01N30/88;G01N33/68
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

本發(fā)明公開了一種基于肽段同位素稀釋質(zhì)譜法的IgG抗體定值方法，包括如下步驟：特征肽段選擇：根據(jù)人源IgG抗體恒定區(qū)的氨基酸序列，確定ALPAPIEK，GPSVFPLAPSSK，DSTYSLSSTLTLSK三條人源IgG恒定區(qū)肽段為定值的特征肽段；特征肽段純度的準(zhǔn)確測定；特征肽段質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化：包括特征肽段質(zhì)譜分析離子對的確定，定量離子對的各質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化；特征肽段線性范圍的確定；人源IgG抗體蛋白樣本分析前處理，主要步驟有：酶切條件優(yōu)化、人源IgG抗體蛋白酶切、濃縮樣品；樣品酶切溶液質(zhì)譜分析后，根據(jù)公式計算人源IgG抗體蛋白樣品中特征肽段含量，根據(jù)人源IgG抗體蛋白和特征肽段的分子量計算溶液中人源IgG抗體蛋白的濃度作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于肽段同位素稀釋質(zhì)譜法的IgG 抗體定值方法。

背景技術(shù)

對通過均勻性、穩(wěn)定性檢驗合格樣料的特性值進(jìn)行測量，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域稱為表征化(英文為characterize，即對材料特性進(jìn)行測量)；由計量權(quán)威部門對表征化獲得的樣料特性的量值進(jìn)行計量學(xué)溯源性(以下簡稱溯源性)確認(rèn)和相應(yīng)測量不確定度評定合理性確認(rèn)，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域稱為定值(英文為certify，即對測量獲得的結(jié)果進(jìn)行認(rèn)證確認(rèn))。因此，對有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值，實際上應(yīng)分為兩步：首先是對經(jīng)過均勻性、穩(wěn)定性檢驗合格的樣料特性值進(jìn)行測量，也就是表征化；然后是對測量結(jié)果的溯源性和測量不確定度評定的合理性進(jìn)行有效性確認(rèn)。

隨著生命科學(xué)和生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用越來越廣泛，需求也越來越大。蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、臨床等各個領(lǐng)域，蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確測量關(guān)系到國家安全、大眾健康和貿(mào)易公平，在臨床檢驗、生物醫(yī)藥等重要領(lǐng)域起著關(guān)鍵作用。面對動態(tài)的生命活動過程，識別和測定蛋白質(zhì)這一復(fù)雜的生物大分子，認(rèn)識其生理功能是非常艱巨和繁重的工作。蛋白質(zhì)含量的計量需要建立蛋白質(zhì)含量相應(yīng)的量值溯源與傳遞體系，使得多肽和蛋白質(zhì)含量測定能夠溯源到SI單位，保證蛋白質(zhì)含量測定的準(zhǔn)確、可比。然而，目前蛋白質(zhì)溯源鏈較長，定值結(jié)果不確定度大，仍需要完善提升已有方法并建立全新的基、標(biāo)準(zhǔn)裝置和基、標(biāo)準(zhǔn)方法，降低蛋白質(zhì)測定結(jié)果的不確定度。

同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS)是應(yīng)用穩(wěn)定同位素進(jìn)行化學(xué)分析的一種方法，在測定蛋白質(zhì)含量時，該方法將一定量的同位素標(biāo)記化合物添加到樣品中，這些同位素標(biāo)記化合物可以是同位素標(biāo)記的元素、氨基酸、肽段或蛋白質(zhì)。待同位素與樣品混合均勻后進(jìn)行水解或酶解的操作，再通過質(zhì)譜技術(shù)檢測反應(yīng)后非標(biāo)記物和標(biāo)記物的比例，由此對蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。該方法現(xiàn)在是蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的主要技術(shù)手段之一。

現(xiàn)在常用的ID-MS法是基于氨基酸的同位素稀釋質(zhì)譜法，而這類方法因為無法區(qū)分來自蛋白樣品或雜質(zhì)的氨基酸，因此對定值的蛋白純度要求很高，一般要大于95％。針對IgG抗體這類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白樣品，對于其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值技術(shù)的研究現(xiàn)在還很少，需要發(fā)展新的特異性更高的定值方法對氨基酸同位素稀釋質(zhì)譜法進(jìn)行補(bǔ)充。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于肽段同位素稀釋質(zhì)譜法的IgG抗體定值方法，測定結(jié)果可以溯源到SI單位，同時3條特征肽段來自人源IgG恒定區(qū)，因此人源IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均可采用該方法定值。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案具體如下：

一種基于肽段同位素稀釋質(zhì)譜法的人源IgG抗體定值方法，基于該方法定值的IgG抗體純度需在90％以上，且不含有其他非目標(biāo)人源IgG雜質(zhì)；

具體包括以下步驟：

(1)特征肽段選擇：根據(jù)人源IgG恒定區(qū)的氨基酸序列，確定ALPAPIEK，GPSVFPLAPSSK，DSTYSLSSTLTLSK三條人源IgG恒定區(qū)肽段為定值的特征肽段；序列如 SEQID NO:1-3所示；