[發明專利]一種基于肽段同位素稀釋質譜法的IgG抗體定值方法

有效

• 申請號: 202110390063.2
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN113125599B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 米薇;戴新華;胡志上;王越珉;游吳凱
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/86;G01N30/88;G01N33/68
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

1.一種基于肽段同位素稀釋質譜法的IgG抗體定值方法，其特征在于：基于該方法定值的IgG抗體純度需在90％以上，且不含有其他非目標人源IgG雜質；

具體包括如下步驟：

(1)特征肽段選擇：根據人源IgG恒定區的氨基酸序列，確定ALPAPIEK，GPSVFPLAPSSK，DSTYSLSSTLTLSK三條人源IgG恒定區肽段為定值的特征肽段，序列如SEQ ID NO:1-3所示；

(2)合成三條特征肽段：ALPAPIEK，GPSVFPLAPSSK，DSTYSLSSTLTLSK，以及三條同位素標記肽段：AL*PAPIEK，GPSVFPL*APSSK，DSTYSL*SSTLTLSK，進行人源IgG抗體蛋白的定量；

(3)特征肽段純度的準確測定；

(4)特征肽段質譜參數的優化：①特征肽段質譜分析離子對的確定，分析合成的標記和非標記特征肽段的母離子和子離子，調節碰撞能量選擇信號最強的離子確定為定量離子對；②對定量離子對的各質譜參數進行優化；

(5)采用液相系統串聯質譜對特征肽段進行質譜分析，質譜采集采用多反應監測(MRM)模式；

(6)特征肽段線性范圍的確定；

(7)準確稱量待測體積的人源IgG抗體蛋白溶液，加入并稱量相應體積的同位素內標溶液；使特征肽段與內標肽段摩爾比為1:1；按溶液中所含人源IgG抗體蛋白質量，根據三條肽段的純度計算酶切后所得三條目標肽段的質量，配制相應濃度標準肽段及同位素內標肽段；

(8)人源IgG抗體蛋白樣本分析前處理：包括酶切條件優化、人源IgG抗體蛋白酶切、濃縮樣品；

1)酶切條件優化：優化方法采用重量法稱取內標肽段儲備液配置內標肽段的混合液，使混合液中每條肽段的摩爾濃度與抗體酶解后各肽段的摩爾濃度相等；再用重量法將抗體蛋白溶液與內標肽段混合液按1:1質量比混合，隨后酶解，比較不同酶切條件下酶切肽段與內標肽段的質譜峰面積比，取峰面積比最高時的酶切條件作為該人源IgG抗體蛋白優化后的酶切條件；

2)優化后的人源IgG抗體蛋白酶切條件為：取人源IgG抗體蛋白溶液與內標肽段混合液按1:1質量比混合，然后用等質量水稀釋一倍后，按照體積比3:1加入乙腈；加入Lys-C蛋白酶(1：50)37℃反應16h；再按照酶的質量/總蛋白質量(w/w)＝1:15，加入胰蛋白酶液37℃酶切24小時，在酶切時間點為4、8、12小時樣品中補加胰蛋白酶液；

3)濃縮樣品：采用真空離心濃縮法對樣品進行濃縮，用0.1mL 0.1％甲酸溶液復溶，上機進行液相質譜檢測；

(9)計算酶解后特征肽段的含量，計算溶液中人源IgG抗體蛋白的濃度作為標準物質的定值結果。