[發明專利]一種重組食甲基丁酸桿菌及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202110389433.0
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN113106047A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 陳可泉;秦家倫;王昕;王雪麟;馬琛
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P7/52;C12R1/145
• 代理公司: 南京擎天知識產權代理事務所(普通合伙) 32465
• 代理人: 涂春春

1.一種重組食甲基丁酸桿菌，其特征在于，所述重組食甲基丁酸桿菌通過轉入含有甲醇利用途徑相關基因或丁酸合成途徑相關基因的質粒，獲得過表達甲醇利用途徑或丁酸合成途徑重組菌株；所述甲醇利用途徑相關基因和丁酸合成途徑相關基因的核苷酸序列分別如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。

2.基于權利要求1所述的重組食甲基丁酸桿菌的構建方法，其特征在于，重組食甲基丁酸桿菌的構建方法包括如下步驟：(1)分別構建重組質粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重組質粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd；(2)對重組質粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重組質粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd分別進行甲基化修飾的重組質粒；(3)再將分別甲基化修飾的重組質粒電轉化進入食甲基丁酸桿菌，構建重組食甲基丁酸桿菌。

3.根據權利要求2所述的重組食甲基丁酸桿菌，其特征在于，所述基因matA,mtaB,mtaC2,atoB,paaH,crt,bcd的Gene ID分別為BUME_RS16910,BUME_RS16905,BUME_RS16900,BUME_RS03485,BUME_RS03475,BUME_RS03480,BUME_RS0347。

4.根據權利要求2所述的重組食甲基丁酸桿菌，其特征在于，所述重組質粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2的構建方法為：使用引物MT3-BamHⅠ-F/MT3-NdeⅠ-R進行PCR擴增來源于食甲基丁酸桿菌的甲基轉移酶相關基因mtaA/mtaB/mtaC2，分別使用BamHⅠ和NdeⅠ雙酶切擴增片段和載體pXY1，酶連后獲得重組質粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2。

5.根據權利要求2所述的重組食甲基丁酸桿菌，其特征在于，所述重組質粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd的構建方法為：使用引物Tchb-HR-F/Tchb-HR-R進行PCR擴增來源于食甲基丁酸桿菌的丁酸合成相關基因atoB/paaH/crt/bcd，將載體線性化后，通過同源重組的方法連接到載體pXY1上，獲得重組質粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd。

6.根據權利要求2所述的重組食甲基丁酸桿菌，其特征在于，將步驟1構建的重組質粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重組質粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd，分別以熱激法轉化進含有pMCljs質粒的大腸桿菌Top10感受態中，隨后培養含有pMCljs和重組質粒的大腸桿菌，并提取總質粒，完成重組質粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和pXY1-atoB/paaH/crt/bcd的甲基化修飾。

7.根據權利要求2所述的重組食甲基丁酸桿菌，其特征在于，將甲基化修飾的重組質粒通過電轉的方式轉化進食甲基丁酸桿菌中，電轉程序為2200v，400Ω；在厭氧箱中以37℃培養3-4天，菌落PCR驗證后獲得重組菌株。

8.基于權利要求1所述的重組食甲基丁酸桿菌在甲醇發酵產丁酸上的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，在平板上挑取重組食甲基丁酸桿菌的單菌落，接種至含有紅霉素的1ml YTF培養基中，培養12-16h后，將離心管中的菌液全部轉接至安剖瓶中，生長至OD₆₀₀為1-1.2，將菌液倒入50ml離心管中，4000rpm離心10min，棄去上清，用PB培養基重懸后以OD₆₀₀＝0.1的接種量接種至50ml PB培養基中，再加入100mM甲醇,每隔一定時間，吸取2ml菌液，離心后將上清液轉移至新的離心管保存，用于高效液相色譜檢測甲醇、丁酸，用2ml超純水重懸后檢測其OD₆₀₀。